インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

このプロトコルは、同じマウスで広視野および単一細胞の予約活動を測定するための大きな頭蓋窓の作成を示しています。本法を用いると、大きくて安定した頭蓋窓をフードラップで低コストで作ることができます。この方法は、行動中の神経およびグリア活動を巨視的および微視的レベルで研究するのに効果的です。

小さな頭蓋窓から始めることをお勧めします。成功した場合は、ウィンドウのサイズを大きくします。歯科用ドリルで頭蓋骨の余分なセメントを取り除くことから始めます。

カットする領域をペンでマークします。先端が頭蓋骨を貫通しないように、先端が鈍いメスを使用して骨に切り込みます。軽く触れるとトリミングする部位の骨が動くまでメスで骨を繰り返しこすり、溝を深くします。

切開した骨を細かいピンセットで取り除きます。脳に損傷を与える可能性のある骨弁を脳に押し込まないように注意してください。硬膜を除去するには、約10マイクロメートルの先細りの先端を持つ引っ張りガラスピペットを使用して硬膜を切断します。

U字型の針を使用して、このカットをウィンドウ全体に拡大します。60〜100倍ズームに設定された実体顕微鏡下で、切断された硬膜を極細ピンセットで取り除きます。出血の場合は、CSFですすぐか、ゼラチンスポンジを使用して出血を止めます。

次に、大きなPVDCラップをオートクレーブ滅菌し、70%エタノールで滅菌します。実体顕微鏡で、ピンセットとメスを使用して、必要なサイズのラップを切り取ります。aCSFを表面に残したまま、ラップを脳表面に置きます。

ラップの端からaCSFを吸い出し、ラップが脳表面にしっかりとくっつくようにします。頭蓋窓の端とラップの間に約1ミリメートルのマージンがあるように、メスとピンセットでラップを切り取ります。ラップが所定の位置に配置されたら、ラップの端を生物学的接着剤で頭蓋骨に接着します。

接着剤を約30分間乾燥させます。ミキシングチップ付きのディスペンサーを使用して、ラップの上に透明なシリコーンエラストマーを塗布します。厚さ0.12〜0.17ミリメートルのカバーガラスを上に置きます。

カバーガラスの周囲を防水フィルム、接着剤、または歯科用セメントでシールします。まず、フィブロインとAAV溶液を小さなサンプルチューブで1対4の比率で混合します。頭蓋窓のラップに溶液のアリコートを落とし、少なくとも3時間乾燥させます。

次に、前のセクションで示したように、ラップを脳表面に取り付けます。マウスとウィンドウの状態を定期的に、2〜4週間チェックしてください。この時までに、遺伝的にコードされたカルシウム指標は、AAV処理ウィンドウを作成した後に十分に発現されるであろう。

このプロトコルを使用すると、頭蓋窓は10匹のマウスのうち8匹で最大10週間維持できました。アストロサイトにおいて膜アンカーされた遺伝的にコードされたカルシウム指標を発現するトランスジェニックマウスにおいて、プラスチックラップ、透明シリコーン、およびカバーガラスで広い窓が作成される。この窓から広視野カルシウムイメージングを行い、反対側のウィスカーにエアパフ刺激を加えると蛍光変化が観察された。

体性感覚皮質における蛍光変化の経時変化は皮質活性を示した。二光子イメージングにより、グリア細胞に特異的な単一細胞蛍光画像の観察が可能となった。感覚刺激によって誘導される蛍光変化は、異なる皮質領域の個々の細胞において観察された。

遺伝的にコードされたカルシウム指示薬を発現するAAVでコードされたラップ;およびフィブロインは、頭蓋窓を作るために使用された。広視野カルシウムイメージングは、手術後2〜4週間で感覚刺激によって誘発された皮質を横切って伝播する皮質活動を示しました。窓が大きかったので、同じマウスの異なる皮質領域が画像化され、感覚刺激によって誘発される蛍光変化が個々の細胞で見られました。

頭蓋窓を作るときは、脳への損傷を避けることが重要です。大きな頭蓋窓を持つマウスで行動タスクを実行できます。これにより、神経活動とマウスの行動との関係を調べることができます。

この方法は、さまざまな神経科学研究に適用できます。例えば、意思決定タスク、運動走行中、および脳損傷および疾患の質量モデルにおける皮質活動を観察するために使用することができる。