Name: アデノウイルスを介した形質導入を用いた天然膀胱尿路上皮における導入遺伝子の発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 学ぶアデノウイルスを用いた天然膀胱尿路上皮への遺伝子導入法。マウス・ラットモデルで約95%の高効率な形質導入を実現し、尿路上皮生物学や膀胱疾患の研究に貢献します。

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この作業は、P30DK079307(MGDへ)、NIH助成金R01DK119183(GAおよびMDCへ)、NIH助成金R01DK129473(GAへ)、米国泌尿器科学会キャリア開発賞、ウィンターズ財団助成金(NMへ)、ピッツバーグ腎臓研究センターの細胞生理学およびモデル生物腎臓イメージングコア(P30DK079307)によるパイロットプロジェクト賞によってサポートされました。 S10OD028596(G.A.へ)は、この原稿で提示された画像の一部をキャプチャするために使用される共焦点システムの購入に資金を提供しました。

<ol><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Urothelium%3A+Life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li>
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<li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li>
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<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984(2021).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li>
<li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463(2014).</li>
<li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+conditional+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li>
<li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li>
<li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Quantitative+Cytology+and+Histology%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li>
<li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li>
<li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+delivery%3A+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li>
<li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal%2Ffusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li>
<li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Molecular+Biology+Organization+journal%22%5BJournal%5D)">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li>
<li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li>
<li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li>
<li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li>
<li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores%3A+identification+of+an+electrostatic+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li>
<li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li>
<li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaching+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804(2018).</li>
<li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888(2022).</li>
<li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

Rameshらは、膀胱癌の治療にアデノウイルス形質導入を使用する戦略の開発に焦点を当てていましたが18、最近の報告では、正常な尿路上皮生物学/生理学および病態生理学の研究におけるこれらの技術の有用性が実証されています10,18,19,20,21。.このアプローチの重要な特徴は、以下を含む:(i)げっ歯類の膀胱壁全体において、尿路上皮のみが形質導入される10、19、20、21、22。<sup c...

尿路上皮は、腎盂、尿管、膀胱、および近位尿道1を覆う特殊な上皮です。それは3つの層で構成されています:高度に分化し分極したしばしば二核傘細胞の層であり、その頂端表面は尿に浸されています。それらの急性喪失に応答して表在性アンブレラ細胞を生じさせることができる二核トランジット増幅細胞の集団を有する中間細胞層。基底細胞の単層であり、そのサブセットは、慢性損傷に応答して尿路上皮全体を再生することができる幹細胞として機能する。アンブレラ細胞は主に、水や溶質に対する透過性の低い頂端膜(コレステロールとセレブロシドが豊富)や、高抵抗の頂端接合複合体(タイトジャンクション、アドヒアレンスジャンクション、デスモソーム、および関連するアクトミオシンリングで構成される)を含む高抵抗尿路上皮バリアの形成に関与しています1。.傘細胞の頂端表面とその接合リングの両方が膀胱充填中に拡張し、排尿後に急速に充填前の状態に戻ります1、2、3、4、5。バリア機能におけるその役割に加えて、尿路上皮はまた、細胞外環境の変化を感知することを可能にする感覚およびトランスデューサー機能を有すると仮定されている(例えば、伸張)そしてメディエーター(ATP、アデノシン、アセチルコリンを含む)の放出を介してこの情報を、下皮下求心性神経突起を含む下層組織に伝達する6,7,8。.この役割の最近の証拠は、Piezo1とPiezo2の両方の尿路上皮発現を欠くマウスで発見され、その結果、排尿機能が変化します9。さらに、傘細胞層でタイトジャンクション孔形成タンパク質CLDN2を過剰発現しているラットは、間質性膀胱炎の患者に見られるのと同様の炎症と痛みを発症します10。尿路上皮感覚/トランスデューサーまたはバリア機能の破壊がいくつかの膀胱障害に寄与する可能性があるという仮説が立てられています6,11。
正常状態および疾患状態における尿路上皮の生物学のより良い理解は、研究者が内因性遺伝子発現を容易にダウンレギュレートしたり、天然組織における導入遺伝子の発現を可能にしたりすることを可能にするツールの利用可能性にかかっています。遺伝子発現をダウンレギュレートする1つのアプローチは、条件付き尿路上皮ノックアウトマウスを生成することですが、このアプローチは、フロックス対立遺伝子を持つマウスの利用可能性に依存し、労働集約的であり、完了するまでに数か月から数年かかる場合があります12。当然のことながら、研究者は尿路上皮をトランスフェクトまたは形質導入する技術を開発しており、これによりより短い時間スケールで結果が得られる可能性があります。トランスフェクションのための公表された方法には、カチオン性脂質13、アンチセンスホスホロチオ化オリゴデオキシヌクレオチド14、またはHIV TATタンパク質につなが留されたアンチセンス核酸透過性11量体ペプチド15の使用が含まれる。ただし、このプロトコルの焦点は、広範囲の細胞への遺伝子送達に効率的である十分に研究された方法論であるアデノウイルス媒介形質導入の使用にあり、多数の臨床試験でテストされており、最近では、COVID-19カプシドタンパク質をコードするcDNAをCOVID-19ワクチンの1つの変異体のレシピエントに送達するために使用されました16。17.アデノウイルスのライフサイクル、アデノウイルスベクター、およびアデノウイルスの臨床応用のより完全な説明については、読者は参考文献17に向けられる。
尿路上皮を形質導入するためのアデノウイルスの使用における重要なマイルストーンは、N-ドデシル-β-D-マルトシド(DDM)を含む界面活性剤による短い前処理が、β-ガラクトシダーゼ18をコードするアデノウイルスによる尿路上皮の形質導入を劇的に増強したことを示したRameshらの報告でした。この原理実証研究をガイドとして、尿路上皮のアデノウイルス媒介形質導入は、RabファミリーGTPアーゼ、グアニンヌクレオチド交換因子、ミオシンモーターフラグメント、孔形成タイトジャンクション関連クローディン、およびADAM17 10、19、20、21、22を含むさまざまなタンパク質を発現するために使用されています10、19、20、21、22.同じアプローチが小さな干渉RNA(siRNA)を発現するように適応され、その効果は導入遺伝子22のsiRNA耐性変異体を共発現することによって救出された。ここで説明するプロトコルには、これらの技術の要件である大量の高濃度アデノウイルスを生成するための一般的な方法、および尿路上皮で導入遺伝子を高効率で発現させるためのRameshらの方法の適応が含まれます18。

<table><tbody><tr><td>10 mLピペット</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4488</td><td>滅菌、血清学的ピペット、個別包装</td></tr><tr><td>12 mL 超遠心チューブ</td><td>ThermoFisher</td><td>06-752</td><td>PET 薄壁超遠心チューブ</td></tr><tr><td>15 mL 円錐形遠心チューブ</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352097</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>18 G ニードル</td><td>BD&nbsp;</td><td>305196</td><td>18 G x 1.5 in ニードル</td></tr><tr><td>20 mL ピペット</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4489</td><td>滅菌血清学的ピペット、個包装</td></tr><tr><td>50 mL 円錐形遠心チューブ</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352098</td><td>滅菌済み</td></tr><tr><td>5 mL ピペット</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4487</td><td>滅菌血清学的ピペット、個包装</td></tr><tr><td>Cavicide</td><td>HenrySchein</td><td>6400012</td><td>抗ウイルス液</td></tr><tr><td>細胞培養ディッシュ - 15 cm</td><td>Falcon (Corning)</td><td>353025</td><td>無菌、組織培養処理済み&nbsp;(150mm×25mmディッシュ)</td></tr><tr><td>細胞スクレーパー</td><td>Sarstedt</td><td>893.1832</td><td>ハンドルの長さ 24 cm、ブレードの長さ 1.7 cm</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>ミリポア シグマ</td><td>C-4306</td><td>分子生物学グレード &ge; 98%</td></tr><tr><td>DMEM 培養培地 (高グルコース)</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td>4.5 g/L グルコース + L-グルタミン + フェノールレッド</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ミリポア シグマ</td><td></td><td>EDS Bioiultra グレード &ge; 99%</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Hyclone (Cytiva)</td><td>SH30070.03</td><td>既定義</td></tr>血清 <tr><td>ガラスピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-20A</td><td>5.75 ガラスピペット、オートクレーブ滅菌</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ミリポア シグマ</td><td>G-5516</td><td>分子生物学グレード &ge; 99%</td></tr><tr><td>HEK293 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK293T細胞は、SV40 large T-antigen Isoflurane を発現する HEK293 細胞の変異体です</td></tr><tr><td></td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>IVカテーテル - マウス</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3063</td><td>24 G x 3/4 in Safety IVカテーテル&nbsp; 放射線不透過性</td></tr><tr><td>IVカテーテル - ラット</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3060</td><td>22 G x 1 in Safety IVカテーテル 放射線不透過</td></tr>性<tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P-9541</td><td>分子生物学グレード &ge; 99%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P5655</td><td>細胞培養グレード&nbsp; &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2HPO4&bull;7 H2O</td><td>ミリポアシグマ</td><td>431478</td><td>&nbsp;&ge;99.99%</td></tr><tr><td>NaCl</td>ミリ<td>ポアシグマ</td><td>S3014</td><td>分子生物学グレード&ge; 99%</td></tr><tr><td>N-ドデシル-&β;-D-マルトシド&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>D4641</td><td>&nbsp;&ge;複数の動物のための98%</td></tr><tr><td>ノーズコーン</td><td>カスタムデザインの</td><td></td><td>商業オプションには、パークランドサイエンティフィック(RES3200)</td></tr><tr><td>PD-10列からのものが含まれます&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-085-01</td><td>Sephadex G-25M</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質 (100x)</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15070063</td><td>100x 濃縮溶液</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>BioPhotometer</td><td></td></tr><tr><td>スタンドとクランプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-679Qと05-769-8FQ</td><td>多数のサプライヤーから入手可能</td></tr><tr><td>滅菌フィルターユニット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(Nalgene)</td><td>09-740-65B</td><td>0.2 & マイクロ;m 急流フィルターユニット (150 mL)</td></tr><tr><td>滅菌フィルターユニット 0.2 &micro;m(シリンジ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>SLGV004SL</td><td>ミリポアシグマミレックス0.22&マイクロ;シリンジに取り付けるmフィルターユニット</td></tr><tr><td>超高速遠心分離機</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>5810R</td><td>エッペンドルフF34-6-38固定角ローター(12,000 rpm)</td></tr><tr><td>シリンジ(1 mL)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309628</td><td>1 mL シリンジ Luer-lok チップ - 滅菌シ</td></tr><tr><td>リンジ (3 mL)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309656</td><td>3 mL シリンジ スリップチップ - 滅菌</td></tr><tr><td>済み卓上遠心分離機(低速)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5702</td><td>スイングバケットローター付き</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-9AM</td><td>ポリエチレン 3.4 mL トランスファーピペット</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>ミリポアシグマ</td><td>648310-M</td><td>分子生物学グレード&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE選択プロテアーゼ溶液</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>12604013</td><td>TrypLE発現酵素 (1x)、フェノールレッドなし</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td> ベ<td>ックマン・コールター</td><td>オプティマ L-80 XP</td><td>ベックマンSW41ローター付き (41,000 rpm)</td></tr><tr><td>気化器&nbsp;</td><td>ジェネラル・アネステティック・サービシズ(General Anesthetic Services, Inc.)</td><td>Tec 3</td>イ<td>ソフルラン気化器</td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>ミキサーVWR10153-838</td><td></td><td>アナログボルテックスミキサー</td></tr></tbody></table>

アデノウイルスを介した形質導入を用いた天然膀胱尿路上皮における導入遺伝子の発現

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

高抵抗バリアを形成することに加えて、腎盂、尿管、膀胱、および近位尿道の内側を覆う尿路上皮は、その環境に関する情報を感知して下にある組織に伝達し、排尿機能と行動を促進すると仮定されています。尿路上皮バリアまたはその感覚/トランスデューサー機能の破壊は、疾患につながる可能性があります。これらの複雑な事象の研究は、尿路上皮における遺伝子およびタンパク質発現を変化させるための単純な戦略の欠如によって妨げられている。ここでは、研究者が大量の高力価アデノウイルスを生成することを可能にし、それを使用してげっ歯類の尿路上皮を高効率で比較的簡単な方法で形質導入することができる方法について説明します。cDNAと低分子干渉RNAの両方をアデノウイルス形質導入を用いて発現させることができ、尿路上皮機能に対する導入遺伝子発現の影響を12時間から数日後に評価することができる。これらの方法は、マウスまたはラット動物モデルを用いた正常および異常な尿路上皮生物学の研究に広く適用できます。

ウイルスの準備 密度勾配遠心分離によるウイルス精製の一例を 図1Aに示す。ロードされた細胞物質と1.25 g / mLのCsCl層の界面に見られる淡いピンク色のバンドは、主に破壊された細胞とその破片で構成されています( 図1Aのマゼンタの矢印を参照)。ピンクがかった色は、プロトコルのステップ1.5から引き継がれた少量の培地に由来します。乳白色のバンドとして現れる目的のウイルス粒子は、1.25 g/mL CsCl溶液と1.40 g/mL CsCl溶液の界面にあります( 図1Aの黄色の矢印を参照)。濃縮されたウイルス粒子の上に2〜3 mm浮かぶ物質の帯を観察することもできます( 図1Aの細い黒い矢印を参照)。組み立てられていないウイルスや破片で構成され、IVPはほとんど含まれていないため、ウイルスサンプルを収集する際には避ける必要があります。
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大量の組換えアデノウイルスを生成するための方法が記載されており、次いで、それを使用して天然のげっ歯類の尿路上皮を形質導入し、導入遺伝子の発現または内因性遺伝子産物のダウンレギュレーションを可能にすることができる。

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

このプロトコルは、研究者が天然の膀胱尿路上皮でCDNAまたはSIRNAを発現できるようにする方法について説明しています。この技術の主な利点は、その比較的単純さ、尿路上皮内のcDNA、siRNAを高効率で、そして比較的短期間で発現する能力である。この技術の最も難しい部分はカテーテル法です。ただし、全体的なテクニックは、一度習得すると比較的簡単に習得できます。手順を実演するのは、私の研究室の研究スペシャリストIVであるジョバンニルイスです。まず、麻酔をかけたマウスをノーズコーンの隣の加熱パッドに置きます。プロトコルの期間中、動物を麻酔下で維持します。つま先をつまんでマウスが完全に麻酔されていることを確認します。膀胱に空気が入らないようにするには、滅菌トランスファーピペットまたはシリンジを使用して、IVカテーテルのプラスチックカテーテル部分と関連するハブに滅菌PBSを充填します。動物を仰臥位にして、外尿道口を70%アルコールで拭きます。次に、外尿道口を形成する組織をそっとつかみ、細かい鉗子を使用して動物から垂直に伸ばします。滅菌カテーテルを外道に挿入します。もう一方の手を使用して、カテーテルを尿道口に約3〜4ミリメートル垂直に慎重に挿入します。次に、外口に挿入されたカテーテルを動物の尾に向かって下げ、恥骨の下を通り、最終的には膀胱に入る尿道の部分への侵入を容易にします。膀胱内の尿が漏れるのを待ちます。下腹部の膀胱隆起をマッサージしてそっと押し下げることにより、クリードの操作を実行して、残りの尿を取り除きます。尿路上皮を形質導入を受け入れやすくするには、PBSで満たされた滅菌1ミリリットルのシリンジをカテーテルハブに取り付けて、マウスまたはラットの膀胱を洗浄します。100マイクロリットルの滅菌PBSをマウスの膀胱に注入します。シリンジをカテーテルフィッティングから取り外した後、PBSを排出させます。滅菌した1ミリリットルのシリンジを使用して、PBSおよび滅菌した0.2マイクロメートルのフィルターに溶解した0.1%N-ドデシル-β-D-マルトシド100マイクロリットルをマウス膀胱に注入します。シリンジを所定の位置に残して、N-ドデシル-ベータ-D-マルトシドを膀胱内に10分間保持します。.N-ドデシル-β-D-マルトシドを膀胱から取り外し、シリンジを取り外して排出させます。.ウイルスを膀胱に導入するには、滅菌1ミリリットルのシリンジをカテーテルハブに取り付け、マウスの場合は100マイクロリットルの滅菌PBS、ラットの場合は450マイクロリットルで希釈した5, 000, 000〜100, 000,000 IVPのアデノウイルスを膀胱に注入します。30分後、シリンジを取り外し、ウイルス溶液が膀胱を使い捨てパッドに排出できるようにします。パッドを廃棄しながら、残留ウイルス溶液を吸収性ワイプで拭き取り、バイオハザード廃棄物で拭きます。動物が回復することを可能にするために、イソフルランの流れを止める。特に動物がグループハウスされている場合は、ケージに戻す前に、動物が回復し、完全に移動できるようにします。mRNA in situハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット、免疫蛍光などの方法を使用して、治療後12〜72時間の導入遺伝子発現の影響を分析します。尿路上皮ライセートのウェスタンブロット分析では、形質導入された膀胱の尿路上皮でV5タグ付きヒト成長ホルモンの発現が明らかになりましたが、形質導入されていない膀胱では発現しませんでした。発現は、ヒト成長ホルモン、またはV5エピトープタグを認識する抗体を用いた免疫蛍光法によっても確認された。ウェスタンブロット分析では、アデノウイルスを形質導入したラットではクローディン-2の発現が確認されましたが、制御されたGFPコードウイルスを形質導入したラットでは確認されませんでした。免疫蛍光分析により、ウイルスをコードするクローディン-2 cDNAで形質導入された尿路上皮傘細胞における外因性クローディン-2発現がさらに確認されました。マウントまたは断面尿路上皮全体の免疫蛍光および共焦点顕微鏡によるタイトジャンクションタンパク質1中の外因性クローディン-2の検出により、細胞質におけるクローディン-2のタイトジャンクションおよび細胞内蓄積の存在が明らかになりました。画像フィールドは、形質導入された傘細胞の数を数えると、95%に近づく効率が明らかになり、膀胱壁全体で尿路上皮のみが形質導入され、他の組織は注入されたアデノウイルスの標的にならないことを示しています。カテーテル法は、プロトコルが意図したとおりに機能するために重要です。この技術により、研究者は正常な尿路上皮生物学を研究し、タンパク質の過剰発現または発現不足が疾患につながる状態を理解することができます。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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起源の臓器への癌細胞の移植は、新規治療法を評価するための有用な前臨床モデルとして役立つことができる。 MB49膀胱癌細胞は、膀胱内注入後の膀胱内に成長させることができる。このプロトコルは、腫瘍移植およびアデノウイルス引渡しのために、マウスの膀胱のカテーテル法を示しています。...

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マウス膀胱腫瘍オルガノイドの培養、操作、および正体移植

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エクスビボ マウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のオルガノイドモデル

エクスビボ 尿路上皮細胞における機械的に活性化されたCa2+ トランジェントの解析

学ぶアデノウイルスを用いた天然膀胱尿路上皮への遺伝子導入法。マウス・ラットモデルで約95%の高効率な形質導入を実現し、尿路上皮生物学や膀胱疾患の研究に貢献します。

アデノウイルスを介した形質導入を用いた天然膀胱尿路上皮における導入遺伝子の発現

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