Name: リアルタイムボイドスポットアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶリアルタイムボイドスポットアッセイによるマウスの排尿行動解析法。明暗期における時間的・空間的・体積的データを収集し、生理学的および神経行動学的研究に応用可能です。

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この研究は、NIH助成金R01DK119183(GAおよびMDCへ)、P30DK079307によるパイロットプロジェクト賞(MGDへ)、米国泌尿器科学会キャリア開発賞およびウィンターズ財団助成金(NMへ)、およびピッツバーグ腎臓研究センター(P30DK079307)の細胞生理学およびモデル生物腎臓イメージングコアによってサポートされました。

<ol><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urothelium%3A+life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The urothelium: life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621(2020).</li>
<li>de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+the+lower+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neural control of the lower urinary tract.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 327(2015).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> JCI Insight. 6 (19), (2021).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+infection+with+uropathogenic+Escherichia+coli+increases+the+excitability+of+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1(2022).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070(2015).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+tight+junction+barrier+dysfunction+sensitizes+bladder+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li>
<li>Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+K%2B+promotes+irritative+voiding+symptoms+and+pain+in+the+face+of+urothelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5509(2019).</li>
<li>Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urological+complications+of+obesity+and+diabetes+in+males+and+females+of+three+mouse+models%3A+temporal+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160(2020).</li>
<li>Bartolone, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micturition+defects+and+altered+bladder+function+in+the+klotho+mutant+mouse+model+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).</li>
<li>de Rijk, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging-associated+changes+in+oxidative+stress+negatively+impacts+the+urinary+bladder+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Neurourology+Journal%22%5BJournal%5D)">Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium.</a> International Neurourology Journal. 26 (2), 111(2022).</li>
<li>Coyne, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+lower+urinary+tract+symptoms+%28LUTS%29+and+overactive+bladder+%28OAB%29+by+racial%2Fethnic+group+and+age%3A+results+from+OAB-POLL%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL.</a> Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230(2013).</li>
<li>Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+bladder+dysfunction%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Diabetic bladder dysfunction: a review.</a> Urology. 123, (2019).</li>
<li>Irwin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+survey+of+urinary+incontinence%2C+overactive+bladder%2C+and+other+lower+urinary+tract+symptoms+in+five+countries%3A+results+of+the+EPIC+study%5BTitle%5D)+AND+%22European+Urology%22%5BJournal%5D)">Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study.</a> European Urology. 50 (6), 1314(2006).</li>
<li>Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symptoms+of+interstitial+cystitis%2C+painful+bladder+syndrome+and+similar+diseases+in+women%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review.</a> The Journal of Urology. 177 (2), 450(2007).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infection+syndromes%3A+occurrence%2C+recurrence%2C+bacteriology%2C+risk+factors%2C+and+disease+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1(2014).</li>
<li>Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+cystitis+is+bladder+pain+syndrome+with+Hunner%27s+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion.</a> International Journal of Urology. 21, 79(2014).</li>
<li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+bladder%2C+cystitis+and+nerve%2Furothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+%26+Clinical%22%5BJournal%5D)">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89(2014).</li>
<li>Rosen, J. M., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pain+from+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Urology.+21+Suppl%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pain from urinary tract infection.</a> International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26(2014).</li>
<li>Birder, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+the+lower+urinary+tract%3A+peripheral+and+spinal+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms.</a> Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128(2010).</li>
<li>Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+rank+in+house+mice%3A+differentiation+revealed+by+ultraviolet+visualization+of+urinary+marking+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns.</a> Science. 182 (4115), 939(1973).</li>
<li>Sugino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voided+stain+on+paper+method+for+analysis+of+mouse+urination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">Voided stain on paper method for analysis of mouse urination.</a> Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548(2008).</li>
<li>Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void+spot+assay%3A+recommendations+on+the+use+of+a+simple+micturition+assay+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).</li>
<li>Rajandram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+urothelial+barrier+function+in+a+mouse+model+of+ketamine-induced+voiding+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).</li>
<li>Ruetten, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uropathogenic+E.+coli+UTI89+model+of+prostatic+inflammation+and+collagen+accumulation+for+use+in+studying+aberrant+collagen+production+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31(2021).</li>
<li>Wegner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void+spot+assay+procedural+optimization+and+software+for+rapid+and+objective+quantification+of+rodent+voiding+function%2C+including+overlapping+urine+spots%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).</li>
<li>Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+noninvasive+measurement+of+cyclophosphamide-induced+changes+in+murine+voiding+frequency+and+volume%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume.</a> The Journal of Urology. 165 (2), 653(2001).</li>
<li>Dmochowski, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+outlet+obstruction%3A+etiology+and+evaluation.+Reviews+in+Urology%5BTitle%5D)+AND+%227+%28Suppl+6%29%2C+S3%E2%80%93S13%22%5BJournal%5D)">Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology.</a> 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).</li>
<li>Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+high+fat+diet+feeding+for+20+weeks+on+lower+urinary+tract+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lower+Urinary+Tract+Symptoms%22%5BJournal%5D)">Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice.</a> Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101(2013).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void+sorcerer%3A+an+open+source%2C+open+access+framework+for+mouse+uroflowmetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170(2019).</li>
<li>Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micturition+video+thermography+in+awake%2C+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Micturition video thermography in awake, behaving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449(2020).</li>
<li>Keller, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voluntary+urination+control+by+brainstem+neurons+that+relax+the+urethral+sphincter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter.</a> Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).</li>
<li>Hou, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+control+circuit+for+context-dependent+micturition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Central control circuit for context-dependent micturition.</a> Cell. 167 (1), 73(2016).</li>
<li>Negoro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+urinary+bladder+Connexin43+and+the+circadian+clock+in+coordination+of+diurnal+micturition+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm.</a> Nature Communication. 3, (2012).</li>
<li>Montalbetti, N., Carattino, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-sensing+ion+channels+modulate+bladder+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).</li>
<li>Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+voiding+spot+assay+in+mice%3A+a+simple+method+with+complex+environmental+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+distribution+of+PIEZO1+in+the+mouse+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303(2019).</li>
<li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+modelling+of+interstitial+cystitis%2Fbladder+pain+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22International+Neurourology+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome.</a> International Neurourology Journal. 22, (2018).</li>
<li>Okinami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+detrusor+gap+junction+communications+induce+storage+symptoms+in+bladder+inflammation%3A+a+mouse+cyclophosphamide-induced+model+of+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis.</a> PLoS One. 9 (8), (2014).</li>
<li>Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Behavior+Tracker%3A+An+economical+method+for+tracking+behavior+in+home+cages%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages.</a> Biotechniques. 63 (5), (2017).</li>
<li>Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronobiology+of+micturition%3A+putative+role+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock.</a> The Journal of Urology. 190 (3), (2013).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

ビデオ監視の組み込みは、従来のVSAに比べていくつかの利点を提供する費用対効果の高い変更です。エンドポイントアッセイとして一般的に使用される従来のVSAでは、重複するボイドスポットを区別することは困難です。マウスは、アッセイが数時間延長されると、通常はケージの隅で同じ領域で複数回排尿する傾向があるため、これは些細な問題ではありません。したがって、RT-VSAの第一の利点は、研究者が部分的または全体的に互いに重ね合わされた個々のスポットを容易に識別できることである。このことは、 図12に示す実験でよく示されています。この場合、ビデオ録画は、マウスが同じコーナーで3回ボイドし、重なり合うボイドスポットを堆積させたことを確認します。実験の最後にのみろ紙を分析した場合、VSAの典型的な方法で、1つのスポットしか区別できませんでした。したがって、古典的なエンドポイントVSAは、排尿行動の大きな違いを特定するのに役立ちますが、より微妙な表現型を区別できない可能性があります。現在の遺伝学の進歩とトランスジェニック動物の生成に伴い、排尿行動を正確に評価できる方法の開発が不可欠です。
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尿の貯蔵と排尿は、骨盤神経と下腹部神経を介して膀胱充満状態に関する情報を受け取る中枢回路(中枢神経系)によって調整されます。尿路上皮は、尿路を腎盂から近位尿道まで裏打ちする上皮であり、尿中に存在する代謝老廃物や病原体に対する強固な障壁を形成します。これは感覚網の不可欠なコンポーネントであり、膀胱の充満状態を感知して下にある組織や求心性神経に伝えます1,2。尿路上皮関門の破壊、または尿路上皮メカノトランスダクション経路の変化は、頻度、切迫感、夜間頻尿、失禁などの下部尿路症状とともに排尿機能障害を引き起こす可能性があります3,4,5,6,7。同様に、老化、糖尿病、下部尿路感染症、間質性膀胱炎、および膀胱に影響を及ぼす他の疾患プロセス、またはその機能を制御する関連回路は、膀胱機能障害を引き起こすことが知られている8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18,19。正常な排尿行動と異常な排尿行動のより良い理解は、異なる排尿パターンを確実に区別できる方法の開発に依存します。
伝統的に、マウスの自発的な排尿行動は、Desjardinsら20によって開発されたボイドスポットアッセイ(VSA)を用いて研究され、その単純さ、低コスト、および非侵襲的アプローチのために広く採用されてきた8、21、22、23、24。このアッセイは通常、エンドポイントアッセイとして行われ、マウスはろ紙で裏打ちされたケージ内で定義された時間過ごし、その後、ろ紙を紫外線(UV)光の下に置いたときの尿スポットの数を数えてサイズを評価することによって分析されます(尿スポットはこれらの条件下で蛍光を発します)20.これらの多くの利点にもかかわらず、従来のVSAにはいくつかの大きな制限があります。マウスは同じ領域で排尿することが多いため、研究者はアッセイの期間を比較的短い期間(≤4時間)に制限する必要があります25。VSAを短時間で実施したとしても、大きな空洞に落ちる小空洞(SVS)を解消したり、尾や足に付着した尿のキャリーオーバーからSVSを判別したりすることはほとんど不可能です。また、SVSが頻繁ではあるが個々の排尿イベント(膀胱炎に反応してしばしば観察される表現型4,26)の結果であるか、排尿後のドリブル(膀胱出口閉塞に関連する表現型)によるものかを区別することも非常に困難です27)。さらに、勤務時間中にアッセイを完了したいという願望は、照明がオフのときに住宅施設にアクセスすることの難しさと相まって、これらのアッセイを24時間の概日周期の明期に制限することがよくあります。したがって、これらの時間的制約は、活動的な夜間のマウス排尿行動の評価を妨げ、概日リズムによって支配される特定の遺伝子または治療を分析する能力を低下させます。
これらの制限のいくつかを克服するために、研究者は排尿行動をリアルタイムで評価するための代替方法を開発しました26,28,29,30,31,32。これらのアプローチのいくつかは、メタボリックケージ26、28、29などの高価な機器の使用、またはサーマルカメラ30の使用を含む。ただし、これらにも制限があります。例えば、代謝ケージでは、尿はメッシュフロアのワイヤーおよび漏斗の壁に付着する傾向があり、収集および測定される尿の量を減少させる。したがって、小さなボイドに関するデータを正確に収集することは困難な場合があります。さらに、メタボリックケージは、排尿事象の空間分布(すなわち、腔の中心に対する隅の排尿)に関する情報を提供しない。サーモグラフィカメラで使用される長波長赤外線は固体を透過しないことを考えると、ビデオサーモグラフィによって評価される排尿活性は、空中で数インチジャンプする可能性があるため、アクティブなマウスでは困難なオープンシステムで実行する必要があります。別のシステムは、マウスケージの金網の床の下で一定の速度で巻き取られるロール状のろ紙で構成される自動ボイドステインオンペーパー(aVSOP)アプローチ33です。このアプローチは、古典的なVSAで発生する紙の損傷と尿の斑点の重なりを防ぎ、その実装により、研究者は数日間にわたって実験を行うことができます。ただし、排尿イベントの正確なタイミングを調査員に提供せず、行動とそれがスポッティングとどのように相関しているかを調べる能力はありません。この情報を得るために、研究者らは、マウスの活動と排尿事象の同時評価を可能にするアプローチである排尿アッセイにビデオモニタリングを組み込んだ31,32。1つのアプローチは、青色発光ダイオード(LED)と緑色蛍光タンパク質フィルターをセットしたビデオカメラを実験ケージの下に配置してボイディングイベントを視覚化し、赤外線LEDとビデオカメラをケージの上に配置してマウスの位置32をキャプチャすることで構成されます。この設定は、ファイバー測光の実行中に排尿動作を監視するために使用されています。しかし、このシステムの明るく照らされた環境では、研究者はマウスを利尿剤で治療して排尿を刺激する必要がありました。別の実験計画では、広角カメラを実験ケージの上下に設置して、マウスの運動活動と排尿イベントをそれぞれ視覚化しました。この場合、ケージ31の下に置かれたUVライトでろ紙を照らすことによって、ケージの床を裏打ちするろ紙に堆積した尿斑が明らかになった。このセットアップは、自発的な排尿行動に関与する脳幹ニューロンを研究するために、その日の明期に4分間の短いアッセイで使用されました31。暗期または>4分の期間の使用に対するこのシステムの適合性は報告されていません。
この記事では、マウスの排尿動作を長期間ビデオで監視できるようにすることで、従来のVSAを強化する方法について説明します。この費用対効果の高いアプローチは、マウスの行動に関連する詳細とともに、一日の明期と暗期の間の長時間の排尿イベントに関する時間的、空間的、および体積情報を提供します3、4、34。ボイディングチャンバーの建設、リアルタイムVSA(RT-VSA)の実装、およびデータの分析に関する詳細情報が提供されます。RT-VSAは、泌尿器系の機能を制御する生理学的メカニズムを理解し、排尿を制御するための薬理学的アプローチを開発し、下部尿路に影響を与える疾患プロセスの分子基盤を定義しようとしている研究者にとって価値があります。

<table><tbody><tr><td>1.00インチX 1.00インチTスロットプロファイル - 4つのオープンTスロット&ndash;&nbsp;10インチにカット</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>金額: 20</td></tr><tr><td>1.00"X 1.00インチTスロットプロファイル - 4つのオープンTスロット&ndash;&nbsp;12インチにカット</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>量: 6</td></tr><tr><td>1.00 インチX 1.00インチTスロットプロファイル - 4つのオープンTスロット&ndash;&nbsp;40インチにカット</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>量: 4</td></tr><tr><td>1.00"X 1.00インチTスロットプロファイル - 4つのオープンTスロット&ndash;14.75インチにカット</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>量: 12</td></tr><tr><td>1.00"X 1.00インチTスロットプロファイル - 4つのオープンTスロット&ndash;32インチにカット</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>量: 5</td></tr><tr><td>1/4-20 ダブルスライドインエコノミーTナット</td><td>80/20</td><td>3280</td><td>量: 16</td></tr><tr><td>1/4-20 トリプルスライドインエコノミーTナット</td><td>80/20</td><td>3287</td><td>量: 18</td></tr><tr><td>10 & 25 シリーズ2穴 - 18mmスロット付き内側コーナーブラケット、デュアルサポート付き</td><td>80/20</td><td>14061</td><td>量: 6</td></tr><tr><td>10 シリーズ3穴 - ストレートフラットプレート</td><td>80/20</td><td>4118</td><td>量: 8</td></tr><tr><td>10 シリーズ 5 穴 - "L" フラット プレート</td><td>80/20</td><td>4081</td><td>量: 8</td></tr><tr><td>10 シリーズ 5 穴 - "T" フラット プレート</td><td>80/20</td><td>4080</td><td>量: 8</td></tr><tr><td>10 シリーズ 5 穴 - ティー フラット プレート</td><td>80/20</td><td>4140</td><td>量: 2</td></tr><tr><td>10 シリーズ 標準リフトオフ ヒンジ - 右手アセンブリ</td><td>80/20</td><td>2064</td><td>量: 2</td></tr><tr><td>10 から 15 シリーズ 2 穴 - ライト トランジション 内側 コーナー ブラケット</td><td>80/20</td><td>4509</td><td>量:</td></tr><tr><td>6 24 インチ - 長い UV チューブ ライト</td><td>ADJ Products LLC</td><td>T8-F20BLB24</td><td>量: 2 20W 電球 &ndash; 24 インチ波長:365nm</td></tr><tr><td>アクリルミラーシート</td><td>プロフェッショナルプラスチック</td><td></td><td>量:1 82.5 cm x 26.5 cm</td></tr>アクリル<tr><td>ミラーシート</td><td>プロフェッショナルプラスチック</td><td></td><td>量:2 26.5 cm x 30.5 cm</td></tr>アクリル<tr><td>ミラーシート</td><td>プロフェッショナルプラスチック</td><td></td><td>量:2 82.5 cm x 30.5 cm</td></tr><tr><td>ARポリカーボネート(UV耐性)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>量: 2 4.5mm 厚さ, 透明, 38.5 cm x 26.5 cm</td></tr><tr><td>AR ポリカーボネート (耐紫外線性)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>量: 4 4.5mm 厚さ, 透明, 38.5 cm x 21.5 cm</td></tr><tr><td>AR ポリカーボネート (耐紫外線性)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>量: 4 4.5mm 厚さ, 透明, 26.5 cm x 21.5 cm</td></tr><tr><td>AR ポリカーボネート (耐紫外線性)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>量: 4 4.5mm 厚さ、透明 37.5 cm x 23.9 cm</td></tr><tr><td>AR ポリカーボネート (耐紫外線性)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>量: 4 4.5mm 厚さ、透明、24.4 cm x 23.9 cm</td></tr><tr><td>クロマトグラフィー紙 (薄い紙)</td><td>&nbsp;サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>コスモスあぶらとり紙(厚紙)</td><td>ブリック アートマテリアルズ</td><td>10422-1005</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>マイクロソフト株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad プリズム</td><td>GraphPad</td><td>ソフトウェア Version 9.4.0</td><td>グラフ作成・統計ソフト</td></tr><tr><td>ImageJ FIJI</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td></td><td>透明フィルム</td></tr><tr><td>Quick Time Player 10.5 ソフトウェア&nbsp;</td><td>アップル</td><td></td><td>のマルチメディアプレーヤー</td></tr><tr><td>セキュリティスパイ</td><td>ベンソフトウェア</td><td></td><td>ビデオ監視ソフトウェアシステム</td></tr><tr><td>標準エンドファスナー、1/4-20</td><td>80/20</td><td>3381</td><td>量:80</td></tr><tr><td>UV透過アクリル</td><td>Spartech</td><td>Polycast Solacryl SUVT</td><td>量:2 38.5 cm x 26.5 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>ウォーターゲル:HydroGel</td><td>ClearH2O&nbsp;</td><td>&nbsp;70-01-5022</td><td>(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)</td></tr><tr><td>ウェブカメラ</td><td>Logitech</td><td>C930e</td><td>数量:4</td></tr></tbody></table>

リアルタイムボイドスポットアッセイ

Real-Time Void Spot Assay

正常な排尿行動は、神経系の適切な制御下にある膀胱、尿道、および尿道括約筋の協調機能の結果です。マウスモデルにおける随意排尿行動を研究するために、研究者は、動物のケージの床に並ぶろ紙に沈着した尿斑の数と面積を測定する方法であるボイドスポットアッセイ(VSA)を開発しました。技術的には単純で安価ですが、このアッセイをエンドポイントアッセイとして使用する場合、排尿イベントの時間的分解能の欠如や、重複する尿スポットの定量化の難しさなど、制限があります。これらの制限を克服するために、リアルタイムVSA(RT-VSA)と呼ばれるビデオ監視VSAを開発し、排尿頻度を決定し、排尿量と排尿パターンを評価し、その日の暗期と明期の両方で6時間の時間枠で測定を行うことができます。このレポートに記載されている方法は、健康状態および疾患状態における自発的排尿の生理学的および神経行動学的側面を調査するさまざまなマウスベースの研究に適用できます。

尿路上皮 ピエゾ1/2 ノックアウトマウスの排尿行動
排尿サイクルの貯蔵段階では、尿路上皮は、膀胱に蓄積された尿によって加えられる張力を感知し、この機械的刺激を漿膜ATP放出などの細胞応答に変換すると仮定されます1,3。我々は以前に、機械的に活性化されたPIEZO1およびPIEZO2チャネルがマウス尿路上皮3,36で発現されることを示した。尿路上皮PIEZOチャネルが正常な排尿行動に重要であるかどうかを判断するために、尿路上皮条件ピエゾ1/2ダブルノックアウトマウス(Pz1/2-KO)マウスおよび年齢および性別を一致させた対照(Pz1/2-C;図9)。雌マウスと雄マウスの両方を、その日の暗期と明期に6時間テストし、ステップ...

本稿では、従来のボイドスポットアッセイにビデオモニタリングを組み込むことで、マウスの排尿行動を研究する新しい方法について説明します。このアプローチは、排尿イベントに関する時間的、空間的、および体積情報と、その日の明期と暗期におけるマウスの動作の詳細を提供します。

Normal voiding behavior is the result of the coordinated function of the bladder, the urethra, and the urethral sphincters under the proper control of the ...

このレポートに記載されている方法は、健康状態および疾患状態における自発的排尿の生理学的および神経行動的側面を理解するために使用できます。この手法により、その日の明るい段階と暗い段階でマウスのボリュームの動作を監視でき、排尿イベントに関する時間的、空間的、および体積情報が提供されます。リアルタイムボイドスポットアッセイまたはRT-VSA記録チャンバーを調製するには、時間帯に応じて、RT-VSA記録ケージの下部に薄いまたは厚いろ紙を置きます。ろ紙の上に、睡眠スペース用のプラスチック製イグルー、濃縮用の滅菌済み1.5 mlマイクロ遠心チューブ、および2〜3個のマウスドライチャウを含む60 mm x 15 mmのプラスチック皿、およびゲルパックの形の14〜16グラムの水。記録チャンバーの準備ができたら、マウスをろ紙にそっと置きます。ハウジングケージから記録ケージへのマウスの移動が最小限のストレスで行われることを確認してください。マウスが記録ケージに入ったら、蓋を置き、蓋の上部を吸収性ベンチの青いパッドで覆い、プレキシガラスの蓋の表面への直接の周囲光の反射を最小限に抑えます。下部チャンバーの紫外線をオンにします。上部と下部のカメラからRT-VSAビデオを録画するには、複数のWebカメラまたはネットワークカメラから同時に録画するように構成されたビデオ監視録画ソフトウェアを使用します。を押して録音を開始します Cmd R プログラムウィンドウで。毎秒1フレームでビデオ録画を実行します。録音を開始した直後に、部屋を出てドアをそっと閉めます。実験全体を通して部屋が静かに保たれていることを確認してください。を押して録音を停止します Cmd T.紫外線をオフにします。録画を停止すると、カメラごとにm4v形式のムービーファイルが自動的に生成され、以前に選択した保存先フォルダーにカメラの名前で保存されます。各カメラのフォルダー内で、実験が日付別にフォルダーに整理されていることを確認します。各日付または実験フォルダーに、1 つの m4v ファイルと、各ムービー フレームに対応する個々の jpeg ファイルがすべてあることを確認します。実験の名前と日付を含むフォルダーをデスクトップに作成し、m4v ファイルをこのフォルダーに転送します。ムービーフォルダをフラッシュドライブにコピーして、外部コンピュータで分析します。下のカメラが明期に収集したムービーファイル、または上側のカメラが暗期に収集したムービーファイルを解析用に開きます。ムービーの品質を評価した後、早送りコマンドまたはタイムバースライダーを使用して正しいタイムウィンドウに移動して実験を分析します。明期中の排尿活動は、午前11:00から午後5:00の間に記録され、暗期には深夜から午前6:00まで記録されます。早送りアイコンをクリックして早送りモードでムービーを再生するか、手動でムービーをスクロールして、マウスが無効になっている証拠を探します。ろ紙に明るい尿の斑点が突然現れるか、ケージの角への移動やマウスが排尿しているときの短時間の非活動など、行動の変化を探します。各ボイドが発生する時刻を登録します。慣例として、排尿の時間は尿が検出された最初の兆候で記録されます。ボイドの測定を行うには、最初にスクロールバーを使用して時間を前後に移動し、尿スポットの最大拡散が発生したポイントを探します。この時点でムービーを一時停止し、分析中の場所にコンピューターのマウス矢印を置いて、スクリーンショットの関心のあるスポットをマークします。スクリーンショットファイルには、ムービーに表示される順序を考慮して相関番号を使用して名前を付けます。すべてのボイドスポットを分析したら、スクリーンショットをキャプチャし、ろ紙の境界を描いて、ろ紙の総面積を測定します。各尿スポットのパーセンテージ面積を計算します。グラフ作成ソフトウェアの検量線と補間機能を使用して、パーセンテージ領域の値を各ボイドスポットの尿量に変換します。雌および雄のPiezo1、2、ノックアウトおよび対照マウスの排尿行動を、その日の暗期および明期に記録した。それらの不活性な明期の間、対照と比較して、雌または雄のノックアウトマウスについて分析されたいずれのパラメータにおいても有意差は観察されなかった。しかしながら、活動的な暗期において、雌および雄のノックアウトマウスは、小さな空隙スポットの数および総体積の有意な増加を特徴とする、変化した排尿表現型を示した。対照マウスと比較して、雌または雄のノックアウトマウスにおいて、一次ボイドスポットまたはPVS数、PVS当たりの平均体積、または総PVS体積に有意差はなかった。雌マウスの排尿行動を、基礎条件下でシクロホスファミド処理後に試験した。基礎条件と比較して、シクロホスファミド治療後の空隙あたりの尿放出量は少なく、排尿イベントははるかに頻繁です。アッセイの再現性を高めるための重要な側面の1つは、動物をできるだけ穏やかに操作し、試験期間全体を通して最小限のストレス下に保つことです。これは非侵襲的なアッセイであるため、膀胱括約筋と外尿道括約筋機能をそれぞれ評価するために、サイトメトリーと筋電図検査を含む追加の手順を後で実行できます。この手法を実装することで、研究者は健康状態や病状における排尿行動に対する特定の経路の寄与を定義することができます。

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

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リアルタイムボイドスポットアッセイ

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