リアルタイムボイドスポットアッセイ
2023年2月10日
本稿では、従来のボイドスポットアッセイにビデオモニタリングを組み込むことで、マウスの排尿行動を研究する新しい方法について説明します。このアプローチは、排尿イベントに関する時間的、空間的、および体積情報と、その日の明期と暗期におけるマウスの動作の詳細を提供します。
このレポートに記載されている方法は、健康状態および疾患状態における自発的排尿の生理学的および神経行動的側面を理解するために使用できます。この手法により、その日の明るい段階と暗い段階でマウスのボリュームの動作を監視でき、排尿イベントに関する時間的、空間的、および体積情報が提供されます。リアルタイムボイドスポットアッセイまたはRT-VSA記録チャンバーを調製するには、時間帯に応じて、RT-VSA記録ケージの下部に薄いまたは厚いろ紙を置きます。
ろ紙の上に、睡眠スペース用のプラスチック製イグルー、濃縮用の滅菌済み1.5 mlマイクロ遠心チューブ、および2〜3個のマウスドライチャウを含む60 mm x 15 mmのプラスチック皿、およびゲルパックの形の14〜16グラムの水。記録チャンバーの準備ができたら、マウスをろ紙にそっと置きます。ハウジングケージから記録ケージへのマウスの移動が最小限のストレスで行われることを確認してください。
マウスが記録ケージに入ったら、蓋を置き、蓋の上部を吸収性ベンチの青いパッドで覆い、プレキシガラスの蓋の表面への直接の周囲光の反射を最小限に抑えます。下部チャンバーの紫外線をオンにします。上部と下部のカメラからRT-VSAビデオを録画するには、複数のWebカメラまたはネットワークカメラから同時に録画するように構成されたビデオ監視録画ソフトウェアを使用します。
を押して録音を開始します Cmd R プログラムウィンドウで。毎秒1フレームでビデオ録画を実行します。録音を開始した直後に、部屋を出てドアをそっと閉めます。
実験全体を通して部屋が静かに保たれていることを確認してください。を押して録音を停止します Cmd T.紫外線をオフにします。録画を停止すると、カメラごとにm4v形式のムービーファイルが自動的に生成され、以前に選択した保存先フォルダーにカメラの名前で保存されます。
各カメラのフォルダー内で、実験が日付別にフォルダーに整理されていることを確認します。各日付または実験フォルダーに、1 つの m4v ファイルと、各ムービー フレームに対応する個々の jpeg ファイルがすべてあることを確認します。実験の名前と日付を含むフォルダーをデスクトップに作成し、m4v ファイルをこのフォルダーに転送します。
ムービーフォルダをフラッシュドライブにコピーして、外部コンピュータで分析します。下のカメラが明期に収集したムービーファイル、または上側のカメラが暗期に収集したムービーファイルを解析用に開きます。ムービーの品質を評価した後、早送りコマンドまたはタイムバースライダーを使用して正しいタイムウィンドウに移動して実験を分析します。
明期中の排尿活動は、午前11:00から午後5:00の間に記録され、暗期には深夜から午前6:00まで記録されます。早送りアイコンをクリックして早送りモードでムービーを再生するか、手動でムービーをスクロールして、マウスが無効になっている証拠を探します。ろ紙に明るい尿の斑点が突然現れるか、ケージの角への移動やマウスが排尿しているときの短時間の非活動など、行動の変化を探します。各ボイドが発生する時刻を登録します。
慣例として、排尿の時間は尿が検出された最初の兆候で記録されます。ボイドの測定を行うには、最初にスクロールバーを使用して時間を前後に移動し、尿スポットの最大拡散が発生したポイントを探します。この時点でムービーを一時停止し、分析中の場所にコンピューターのマウス矢印を置いて、スクリーンショットの関心のあるスポットをマークします。
スクリーンショットファイルには、ムービーに表示される順序を考慮して相関番号を使用して名前を付けます。すべてのボイドスポットを分析したら、スクリーンショットをキャプチャし、ろ紙の境界を描いて、ろ紙の総面積を測定します。各尿スポットのパーセンテージ面積を計算します。
グラフ作成ソフトウェアの検量線と補間機能を使用して、パーセンテージ領域の値を各ボイドスポットの尿量に変換します。雌および雄のPiezo1、2、ノックアウトおよび対照マウスの排尿行動を、その日の暗期および明期に記録した。それらの不活性な明期の間、対照と比較して、雌または雄のノックアウトマウスについて分析されたいずれのパラメータにおいても有意差は観察されなかった。
しかしながら、活動的な暗期において、雌および雄のノックアウトマウスは、小さな空隙スポットの数および総体積の有意な増加を特徴とする、変化した排尿表現型を示した。対照マウスと比較して、雌または雄のノックアウトマウスにおいて、一次ボイドスポットまたはPVS数、PVS当たりの平均体積、または総PVS体積に有意差はなかった。雌マウスの排尿行動を、基礎条件下でシクロホスファミド処理後に試験した。
基礎条件と比較して、シクロホスファミド治療後の空隙あたりの尿放出量は少なく、排尿イベントははるかに頻繁です。アッセイの再現性を高めるための重要な側面の1つは、動物をできるだけ穏やかに操作し、試験期間全体を通して最小限のストレス下に保つことです。これは非侵襲的なアッセイであるため、膀胱括約筋と外尿道括約筋機能をそれぞれ評価するために、サイトメトリーと筋電図検査を含む追加の手順を後で実行できます。
この手法を実装することで、研究者は健康状態や病状における排尿行動に対する特定の経路の寄与を定義することができます。
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概要
この記事では、従来の排尿スポットアッセイにビデオモニタリングを組み込むことで、マウスの排尿行動を研究する新しい方法について説明します。この方法は、排尿イベントと日中の光と暗の段階におけるマウスの行動の詳細に関する時間的、空間的、体積的情報を提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 行動生物学
- 生理学
背景
- 排尿を理解することは膀胱機能の研究にとって重要です。
- マウスモデルは一般的に尿行動を調査するために使用されています。
- 従来の方法では詳細な行動洞察が欠けている可能性があります。
- ビデオモニタリングは排尿アッセイでのデータ収集を強化できます。
研究目的
- マウス用のリアルタイム排尿スポットアッセイ（RT-VSA）を開発すること。
- 排尿行動に関する包括的なデータを収集すること。
- 光と暗の段階における行動の違いを分析すること。
使用方法
- フィルターペーパーを使用した記録チャンバーの準備。
- マウスのための環境エンリッチメントの組み込み。
- ビデオ技術を用いた排尿イベントのモニタリング。
- 異なる光条件下でのマウス行動の評価。
主な結果
- 排尿モニタリングのためのRT-VSAの成功した実装。
- 排尿イベントに関する詳細な時間的および空間的データの収集。
- 光と暗の段階におけるマウス行動の違いに関する洞察。
- 尿路障害の研究における潜在的な応用。
結論
- RT-VSA方法は排尿の理解を強化します。
- ビデオモニタリングは豊富な行動データを提供します。
- この方法は様々な健康と疾患の研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The Real-Time Void Spot Assay (RT-VSA) enables high-resolution, quantitative assessment of voluntary voiding behavior in mouse models, providing temporal, spatial, and volumetric data critical for mechanistic de-risking in early discovery. This capability supports target validation and pathway interrogation for bladder and neurobehavioral research, reducing ambiguity in preclinical model selection. RT-VSA enhances predictive confidence for portfolio decisions involving urinary physiology and disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of physiological and neurobehavioral pathways underlying micturition.
- Supports functional target validation by quantifying voiding frequency and volume in genetically modified models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing phenotypic changes across light and dark phases.
- Improves predictive confidence for advancing disease-relevant targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible measurement of voiding events for downstream pharmacological screening.
- Generates quantitative outputs (void frequency, volume, pattern) suitable for assay development.
- Enables reliable comparison of compound or genetic interventions in preclinical models.
- Supports scalability and platform reuse across multiple studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical voiding phenotypes with translational biomarkers of urinary function.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling noninvasive, longitudinal assessment.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust behavioral endpoints.
- Facilitates integration with downstream analyses such as cytometry and electromyography.
Pipeline & Workflow Integration
RT-VSA fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and phenotypic screening in mouse models of urinary function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of micturition pathways and biological de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative voiding data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides temporal and volumetric measurements to compare experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Bridges preclinical findings to disease-relevant endpoints and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, noninvasive platform adaptable to diverse genetic and pharmacological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes behavioral phenotyping with reproducible, scalable protocols.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of urinary and neurobehavioral targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral phenotyping and quantitative image analysis.
- Needs video monitoring infrastructure and analytical software for data extraction.
- Demands cross-team standardization to ensure reproducibility and data integrity.
- Adaptable to various mouse models and experimental conditions with minimal invasiveness.
- Dependent on careful animal handling to minimize stress and maximize assay reliability.
