マウスにおける連続局所キメラ抗原受容体(CAR)T細胞注入のための頭蓋内カニューレ移植
February 24th, 2023
中枢神経系(CNS)腫瘍は、小児のがん関連死の主な原因であり、局所免疫ベースの治療法は、臨床試験で患者に対してますますテストされています。このプロトコルは、CNS腫瘍を標的とする免疫療法注入の前臨床評価のためのマウスへの局所カニューレ移植の方法を記載しています。
このプロトコルは、中枢神経系腫瘍を対象としたCAR-T細胞療法の局所局所送達をテストするために進行中の臨床試験で使用される脳室内カテーテルシステムを複製します。この技術の主な利点は、複数の侵襲的外科的処置を行うことなく、局所局所CAR T細胞療法の複数回反復投与を提供できることです。このシステムは、異なる送達部位の異なる治療法を調査するために使用でき、したがって、神経科学の無数の研究分野への洞察を提供する可能性があります。
まず、頭を坊主した麻酔をかけたマウスを手術台に置き、ヘラを使って定位アームの底をそっと開きます。カニューレを鉗子で挿入し、白いプラスチック部分の半分から3分の2、カニューレの5ミリメートルが開口部の底から突き出るまでアームのネジを締めて固定します。マウスの上歯を脳定位固定装置のバイトバーに挿入して固定します。
ノーズコーンを前方に引いて締め、マウスがイソフルランを吸入することを確認します。次に、過度の圧力を避けて、イヤーカフまたはイヤーバーを使用して、温められた定位固定装置にマウスを取り付けます。手術部位を消毒し、原稿に記載されているように頭蓋骨と平行に切り込みを入れます。
綿先綿棒を使用して筋膜を押しのけます。頭蓋板が出会う前部と後部のマークに対応する頭蓋骨のランドマーク、ブレグマとラムダを特定します。アクリルを取り付けるための表面を作成するには、メスを使用して頭蓋骨全体にいくつかのスリットをそっと作成します。
定位固定アームを使用して、カニューレを目的のランドマークにローカライズします。カニューレの先端を頭蓋骨の表面から1〜2ミリメートル上に上げ、目的の座標に移動します。18ゲージの針または外科用ドリルを使用して、カニューレが入る場所から離れた露出した頭蓋骨に2つのネジ穴を開け、カニューレ用の十分なスペースを確保します。
頭蓋骨に取り付けられるまでドリルをネジ穴にねじります。マイナスドライバーを使用して、2本のネジを穴に挿入して固定します。次に、ネジをそっと引き上げて、ネジが固定されていることを確認します。
カニューレを挿入するには、18ゲージの針または外科用ドリルを使用して、識別された座標で頭蓋骨に穴を開けます。定位アームを使用して、カニューレを目的のDV座標まで下げます。磁器の12ウェルプレートに約0.3グラムのアクリル樹脂粉末と10〜15滴の液体を入れて、調製した粘性のある白色材料を1ミリリットルのシリンジに入れます。
頭蓋骨をコーティングし、カニューレとネジの周りのスペースを埋めます。セメントが柔軟である間に定位アームのネジを緩めます。スパチュラをそっと使用して、下部開口部のホルダーからカニューレを解放し、定位アームをマウスから引き離します。
セメントが乾いたら、ダミーのカニューレをガイドカニューレに挿入し、時計回りに回転させてしっかりと固定します。手順が完了したら、マウスを温めたホームケージに戻して回復させます。治療用カニューレを準備するには、その上部をPKGチューブに挿入します。
次に、治療用シリンジにCAR T細胞懸濁液を満たし、治療用カニューレの上部を覆うPKGチューブのもう一方の端に挿入します。マウスを麻酔した後、鉗子を使用してガイドカニューレを基部に固定します。ダミーカニューレを緩めて取り外し、ガイドカニューレにアクセスできるようにします。
CAR T細胞を1分間注入し、治療用カニューレをさらに1分間所定の位置に保持します。治療用カニューレを取り外した後、ダミーのカニューレをしっかりとねじ込みます。次に、疼痛管理のためにメロキシカムを皮下投与する。
GPC2指向性CAR T細胞療法は、髄芽腫において有意な腫瘍退縮を誘導し、視床びまん性正中線神経膠腫モデルにおいて有意に生存期間を延長した。ガイドカニューレを腫瘍内の場所に挿入する場合、ダミーおよび治療用カニューレの突起長を説明するために、背側と腹側の座標が腫瘍注射よりも表面的である可能性があることを理解することが重要です。
概要
このプロトコルは、マウスにおける局所注入用カニューレの埋め込み方法を概説し、中枢神経系腫瘍を標的とする免疫療法注入の前臨床評価を促進します。この技術により、複数の侵襲的な手術を必要とせずに、CAR T細胞療法の繰り返し投与が可能になります。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 免疫療法
背景
- 中枢神経系腫瘍は小児のがん関連死の主な原因です。
- 局所的な免疫ベースの治療法が臨床試験で試験されています。
- CAR T細胞療法は中枢神経系腫瘍の標的治療に有望です。
- このプロトコルは、進行中の臨床試験で使用されている脳室内カテーテルシステムを再現しています。
研究目的
- 前臨床モデルでCAR T細胞療法の有効性を評価すること。
- 治療薬の局所投与方法を提供すること。
- 動物モデルにおける繰り返し治療の侵襲性を最小限に抑えること。
使用方法
- 定位装置を用いたカニューレの埋め込み。
- 埋め込まれたカニューレを通じたCAR T細胞療法の投与。
- 動物の福祉を確保するための麻酔と外科技術の使用。
- 治療後の腫瘍反応と生存率の結果のモニタリング。
主要な結果
- GPC2標的CAR T細胞療法は著明な腫瘍縮小を誘導しました。
- 視床に広がる中線性膠芽腫モデルでは著明な生存期間の延長が観察されました。
- この方法により、標的領域への治療の正確な投与が可能になります。
- 得られた洞察は、神経科学と腫瘍学の将来の研究に情報を提供する可能性があります。
結論
- このプロトコルは、中枢神経系腫瘍の研究に価値あるツールを提供します。
- CAR T細胞療法の有効性の理解を深めます。
- このアプローチは中枢神経系腫瘍の治療戦略の改善につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Serial intracranial cannula implantation enables repeated locoregional CAR T cell delivery in preclinical CNS tumor models, directly addressing the challenge of evaluating immunotherapies in anatomically relevant, disease-relevant systems. This approach increases predictive confidence for translational advancement by mirroring clinical catheter-based delivery and supporting robust, quantitative assessment of therapeutic regimens. The platform is strategically positioned to inform target validation and dosing strategies for pediatric and adult CNS oncology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of CAR T cell efficacy against validated CNS tumor antigens in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by isolating locoregional effects and minimizing systemic confounders.
- Facilitates iterative hypothesis testing for target engagement and tumor response.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible platform for serial dosing and response measurement.
- Enables quantitative assessment of tumor regression and survival following repeated CAR T cell infusions.
- Supports assay development for evaluating delivery site-specific therapeutic effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical delivery methods with clinical catheter-based protocols for translational continuity.
- Allows for risk-adjusted advancement decisions based on robust, serial in vivo data.
- Supports biomarker and pharmacodynamic studies in orthotopic CNS tumor models.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling serial, site-specific immunotherapy delivery in orthotopic CNS tumor models, supporting lead identification and translational assessment.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven testing of CAR T cell constructs and tumor antigen targets in vivo.
- Screening: Standardizes repeated dosing and quantitative tumor response measurement for candidate prioritization.
- Analytics: Provides survival and tumor regression data for comparative analysis across regimens and delivery sites.
- Translational Research: Mirrors clinical catheter-based delivery, supporting preclinical-to-clinical workflow alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable for testing diverse cell therapies and novel agents in CNS disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS immunotherapy studies.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable serial dosing in preclinical models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency for CNS oncology programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and small animal CNS procedures.
- Demands access to stereotactic apparatus, surgical tools, and analytical infrastructure for tumor monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of dosing, infusion protocols, and response criteria.
- Adaptable to various CNS tumor models and delivery coordinates with protocol optimization.
- Dependent on precise anatomical targeting and post-surgical animal care for reproducibility.
