Name: 光制御された生物学的に活性な化合物のin vitroおよびin vivo評価-癌光薬理学の潜在的な薬剤候補 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: 学ぶ光制御型抗がんペプチドの評価法。2D・3D細胞培養での細胞毒性アッセイ、光異性化効率測定、in vivo効能評価のプロトコルを確立し、がん光薬理学の新規薬剤候補探索に応用する。

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著者らは、ペリコ(#690973)およびALISE(#101007256)プロジェクトを通じたH2020-MSCA-RISEプログラムによるEUの資金提供を認めている。この研究は、DFG-GRK 2039(SA、TS、ASU)、ヘルムホルツ協会のNACIPプログラム(SAおよびASU)、およびBMBFのVIP+(OBおよびASU)によってサポートされました。化合物LMB002を合成し、精製し、研究のために化合物を提供してくださったカールスルーエ工科大学のSerhii Koniev博士に感謝します。著者はまた、ウクライナでビデオを撮影および編集したChupryna Maksymと、この出版物の実験的な作業、執筆、撮影を可能にしたウクライナのすべての勇敢な擁護者に感謝しています。

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</ol>

IVK、OB、SA、およびASUは、Lumobiotics GmbHにライセンス供与された「光制御生物学的活性を有するペプチド模倣薬」(WO2014127919 [A1]、EP2958934 [B1]、US9481712 [B2]、UA113685 [C2])の発明者です。 IVK、OB、TS、およびSAはLumobiotics GmbHの創設者および株主です。 IVKは科学顧問であり、HK、TM、IP、およびPBはEnamine LLCの従業員です。著者は、開示されているものを除いて、出版物で説明されている主題または資料に金銭的利益または金銭的矛盾を持つ組織または団体と他の関連する提携または財政的関与を持っていません。

光制御化合物は、医薬品開発において前例のないものです。しかし、それらの前臨床的および臨床的評価のための方法は確立されていない。最も近い単剤療法アナログである光線力学療法(PDT)は、癌に対して多くの国で採用されている臨床使用の治療法であり、他の適応症のために開発中です19,20。光薬理学と同様に、PDTも光を使用して生理活性物質(一重項酸素)を活性化することに基づいています。したがって、PDTの前臨床試験および臨床試験に使用されるいくつかの実験方法を光薬理学に採用することができます。たとえば、光源、光配信アプローチ、および医療機器は十分に開発され、PDT用に承認されています。それらは光制御薬物の評価に直接使用することができます。ただし、PDTと光薬理学には互いに多くの違いがあり4、後者の特定の方法を確立する必要性を正当化します。
第一に、PDT(酸素)中の非活性化物質は、非毒性濃度で生体組織中に常に存在する。対照的に、活性化されていない光制御生物学的活性化合物は、残存活性および望ましくない毒性を有し得る。したがって、理想的な光薬理学的薬物は、投与された形態では生物学的活性を最小限に抑え、光生成形態で非常に活性が高くなければならず、「光線療法ウィンドウ」21 は可能な限り大きくなければなりません。ヒットを見つけてヒットtoリード最適化を実行するには、すでに医薬品開発の初期段階にある、適切な化合物の同定と比較的大規模なライブラリのスクリーニングが必要です。ここでは、効率的な光スイッチング化合物を同定するための自動ハイスループット共焦点蛍光顕微鏡法を提案しました。
選択された細胞毒性評価方法は、最も重要な要件 - PSSの維持または可視光感受性光異性体の安定性 - を容易に実施することを可能にする。これは、その実装時に、光の露出が最小限に抑えられるためです。したがって、別の方法を選択する場合は、自動化された方法をお勧めします。このアプローチは信頼性が高く有益です。この段階で3D細胞培養(スフェロイド)を使用することで、より現実的な組織様微小環境での治療に対する細胞の反応を全体的に理解することができます。さらに、化合物の作用機構に関する貴重な洞察は、直接法として顕微鏡法を使用して得ることができます。適切な染色プロトコルを備えた共焦点蛍光顕微鏡法により、細胞とスフェロイドの形態を視覚的に評価できます。細胞死や細胞内の変化に関する重要な詳細も検出できます。
第二に、軽い適用は軽い投与量の慎重な選択を必要とします。PDTでは、軽い過剰摂取は組織に非常に有害です22。光薬理学的療法は、過度の光照射下で有利であり得る。活性化物質の上限は、非活性化物質の投与量およびその薬物動態によって規定される。しかし、光線量は依然として光薬理学における問題です。照射力密度と露光時間が治療 の要件以上である ことを確認するように注意する必要があります。原則として、活性化物質の生成は インビボでモニターすることができる。しかし、生命倫理上の理由から、我々はモデル組織(新鮮なひき肉)に非活性化化合物15を混合した実験を提案した。この実験は簡単で、さまざまな光源を使用するように変更できます。また、光線量の光物理学的推定や熱影響の測定にも適応できます。ここでもまた、モデル組織を用いることによって、光曝露を最小化することが可能であり、例えば、 インビボ 条件におけるより正確な光スイッチング効率決定と比較して、常に検討することが興味深いかもしれない代替案である。
最後に、in vitro 毒性スクリーニングにおいて優れた特性を示し、モデル組織において少なくとも1〜1.5cmの深さで効率的に光スイッチングする化合物は、費用がかかり、手間がかかり、時間のかかる in vivo 研究のために選択することができる。このプロトコルでは、 in vitro 評価と同じ細胞株(LLC)を使用して、同種移植がんモデルを作成しました。腫瘍増殖動態、死亡率、および転移数は、抗がん効果の評価に最も適したパラメータです。従来の化学療法と比較して、追加の要因が光薬理学的治療に適用されます - 光。したがって、2つの対照動物群、すなわち、ビヒクルのみを受け取る動物群と、ビヒクルおよび照射を受ける動物群の2つが必要である。このセットアップにより、測定パラメータに対する光の影響を評価できます。本発明者らの実験では、2つの実験群の動物に非活性化化合物を投与し、一方の群のマウスの腫瘍に放射線を照射した。照射レジームは、対照群と治療群で同一でした。実験の主な目的は、光と化合物の適用の複合効果を実証することであるため、ベンチマーク化学療法との比較はこの段階では必要ありません。次に、この効果を示す最も優れた化合物を選択して、 in vivo 毒性に関するさらなる研究と、それらの開発に関する重要な決定を下すためのベンチマークとの比較を行うことができます。技術的には、我々が説明する インビボ 実験は、例えば、薬物リードとしてすでに選択されている化合物の薬物動態学的または薬力学学的研究に容易に適合させることができる。

光制御された生物学的に活性な化合物は、ヒト疾患に対する安全な化学療法の有望な成分として、また悪性固形腫瘍を特異的に根絶するために、ここ数十年で登場しました1。これらの化合物は可逆的に光異性化可能なフラグメント(分子光スイッチ)を含み、異なる波長の光を照射すると不活性な光異性体と活性な光異性体を切り替えることができます。
光制御性のない類似体と比較して、光制御薬は、活性が低く本質的に毒性のない形で患者の体内に全身的に導入でき、腫瘍、潰瘍、創傷などの必要な場合にのみ光によって活性化されるため、より安全である可能性があります。このような分子医薬品のプロトタイプの複数のエキサイティングなデモンストレーションは、最近の学術論文2,3,4,5,6,7で見つけることができますが、承認された薬/医療機器/疾患の組み合わせの応用である臨床光薬理学の分野は存在しません。光薬理学はまだ創薬段階にあり、体系的な前臨床試験は不明です。
ごく最近になって、いくつかの光制御抗癌ペプチド、すなわちペプチド抗生物質グラミシジンS8の類似体に対するin vivoの安全性の利点を実証しました。これらの光制御誘導体は、ジアリールエテン(DAE)光スイッチを含み、いわゆる赤色光生成「開環」光線とUV生成「閉環」光線の間で可逆的な光誘起変換を受ける(誘導体の1つである化合物LMB002について図示)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig01.jpg"> 図1:光制御細胞傷害性ペプチドLMB002とその光異性化。 ジアリールエテンフラグメントを赤色で示す。略称:DAE =ジアリールエテン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ヒットを見つけ、ヒットtoリード最適化を実行するには、多くの場合、適切な化合物ライブラリのin vitroおよびin vivoスクリーニングが必要です9,10。ここでは、光制御化合物の細胞毒性の体系的なハイスループットスクリーニングに適した方法論を示します。また、光異性化効率を決定し、モデル組織における光線量を推定し、最もパフォーマンスの高い候補のin vivo有効性を評価します。このアプローチは、生命倫理と動物飼育の考慮事項に準拠しています。
この研究では、試験された化合物の制御されていない光異性化を回避するために、従来の前臨床方法が変更されています。本明細書においてこれらの改変方法を適用する全体的な目標は、in vitro 活性を確実に比較し、リード同定およびさらなる開発のための光切り替え可能な化合物の in vivo 有効性試験を合理化するための、簡単で迅速で統計的に有意なデータを生成する一般的な戦略を開発することである。
この戦略は、3つの連続したステップで構成されています。最初のステップでは、2次元(2D、単層)および3次元(3D、スフェロイド)細胞培養および共焦点ハイスループット自動蛍光顕微鏡を使用して、選択した光制御生物学的に活性な化合物の活性および不活性光形態の段階希釈液中のIC50 (見かけの50%細胞生存率)を測定します。光線療法ウィンドウは、2つの光形態間のIC50 差に関して比較され、最も性能の高い候補が選択される。自動顕微鏡検査やその他の細胞毒性スクリーニングプラットフォーム(アッセイ)による毒性評価には特別な利点はありません11。より複雑な細胞ベースの腫瘍モデル12 は、この段階で容易に実施することができる。
ステップ1で選択した化合物について、第2ステップは、照射されたサンプル抽出物のUV検出高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して、組織サロゲート中の活性の低い光形態の光スイッチング効率を定量することにより、照射された組織表面からの深さの関数として組織内の光スイッチング効率を現実的に推定することです。 in vivoでは 、光スイッチング効率を研究することができますが、単純な組織代理である豚ひき肉を使用することを提案します。このアプローチの妥当性をテストしました。マウスのがんモデルで in vivo での光スイッチ性化合物の変換を測定し、マウス8を用いた以前の実験で測定された深さでほぼ同じ光変換を観察しました。任意の適切な代替人工組織13、3Dバイオプリント組織/器官14、生検材料、または別の免除動物材料を使用することができる。ただし、この設定は経済的、高速、倫理的であるため、適切な妥協案です。
第3のステップは、マウス癌モデルにおける in vivo 抗癌有効性の決定である。 in vitro 実験で優れた特性を示し、モデル組織で少なくとも1〜1.5cmの深さで効率的に光スイッチングを示す化合物をこの実験用に選択します。
このプロトコルは、それらの光形態(またはそれらの光定常状態、PSS)が妥当な時間(数日以上)安定していれば、異なるタイプの光スイッチを有する化合物に適用することができる。説明のために、前述のDAE由来のLMB002が15使用される。LMB002フォトフォームは熱的に安定しており、実質的な劣化なしに少なくとも1年間-20°Cで保存できます。ルイス肺癌(LLC)細胞は、このイン ビトロ および インビボ のデモンストレーションのために選択されますが、細胞の種類に制限はありません。LLC細胞は接着性であり、3Dで容易に培養可能であり、そして腫瘍様を生成するために使用される(参考文献16に記載されているように)。 生体内 LLC細胞は転移過程をモデル化するために使用され、皮下注射後に免疫適格マウスにおいて固形腫瘍を容易に生成することができる。この in vivo 方法論は、他の癌モデルに普遍的に適用することができる17、18。この戦略の詳細な実装については、以下で説明します。

<table><tbody><tr><td>Agilent 1100シリーズキャピラリーLCシステム</td><td>ALSI-Chrom(Agilentディストリビューター)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ATCC CRL-1642、LL / 2(LLC1)ルイス肺癌細胞株</td><td>ECACC</td><td>90020104</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6NCrlマウス、雌、近交系</td><td>チャールズリバー</td><td>株コード:027</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture、CO2インキュベータ</td><td>ーEsco Micro</td><td>CCL-170B</td><td></td></tr><tr><td>コーニング マトリゲル基底膜マトリックス</td><td>メルク</td><td>CLS354234</td><td></td></tr><tr><td>コーニング、384ウェルスフェロイドマイクロプレート</td><td>メルク</td><td>CLS3830</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>メルク</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gibco、DPBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21600044</td><td></td></tr><tr><td>グラミシジン S</td><td>ルモバイオティクス</td><td></td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>HyClone、DMEM/高グルコース</td><td>Cytiva</td><td>SH30003.04</td><td></td></tr><tr><td>IN Cell Analyzer 6500HS、イメージングシステム</td><td>Cytiva</td><td>29240358</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen、Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン麻酔器</td><td>ASA</td><td>S/N ASA 1305</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン、200 mM 溶液</td><td>Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LIKA外科医、ダイオード手術レーザー</td><td>Fotonika</td><td></td> plus-LMB002 <td></td></tr><tr><td></td><td>Lumobiotics</td><td></td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>ペニシリン&ndash;ストレプトマイシン、溶液安定化メル</td><td>ク</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate、96ウェルプレート</td><td>PerkinElmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>光度計PCE-LED 20</td><td>PCE機器</td><td>PCE-LED 20</td><td></td></tr>サー<tr><td>モサイエンティフィック、Hoechst 33342</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>62249</td><td></td></tr>サー<tr><td>モサイエンティフィック、ヨウ化プロピジウム</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>J66764-MC</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー、0.4%溶液</td><td>メルク</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン&ndash;EDTA、10 x 溶液</td><td>Merck</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz 細胞培養フラスコ、ベントキャップ付き、75 cm2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200263</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz、ボトルトップフィルター、PES、0.22 &mu;m</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360882</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP、C18 HPLCカラム(4.6 mm&times; 250 mm、5 &micro;m)</td><td>Altmann Analytik (Avantorディストリビューター)</td><td>GR5103827</td><td></td></tr></tbody></table>

光制御された生物学的に活性な化合物のin vitroおよびin vivo評価-癌光薬理学の潜在的な薬剤候補

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

光制御された生物学的に活性な化合物は、「スマート」医薬品候補の新たなクラスです。それらは、良性の非イオン化可能な光を患者の体内の特定の場所に向けることにより、正確な時空間活性化により、全身化学療法の安全性を高めます。この論文では、光制御された生物学的に活性な化合物の光活性化の in vitro 効力と ex vivo効率、および医薬品開発の初期段階でin vivo の有効性を評価するための一連の方法を示します。この方法論は、抗癌細胞傷害性ペプチド、すなわち既知の抗生物質であるグラミシジンSのジアリールエテン含有類似体に適用される。実験は、免疫適格マウスにおける癌細胞株(ルイス肺癌、LLC)、生きた組織代理(豚肉ミンチ)、および同種移植癌モデル(皮下LLC)の2D(接着細胞)および3D(スフェロイド)細胞培養を使用して実行されます。最も効果的な化合物の選択と現実的な光線治療ウィンドウの推定は、自動蛍光顕微鏡によって行われます。さまざまな照明レジメンでの光活性化効率は、モデル組織のさまざまな深さで決定され、最適な光線量が最終的な治療 的in vivo 実験に適用されます。

この研究では、2Dおよび3Dセル実験を実施して、異なるインキュベーション時間でのLMB002の「リングクローズ」および「リングオープン」形態のIC50 を決定しました( 図1を参照)。これらの値を、プロトタイプペプチドであるグラミシジンS(ポジティブコントロールとして使用)について得られた値と比較した。染色後の2D成長LLC培養物におけるインキュベーションの典型的な一連の画像を 図5に示す。Hoechst 33342(青)およびヨウ化プロピジウム(赤)との共染色は、「リングクローズ」と比較して「リングオープン」形態で処理した場合に、より大きな部分の細胞で異なる紫色の色合いをもたらし、容易に定量化できる2つの形態間の細胞毒性の顕著な違いを示しています。実験の成功例の実証例は、 図2に示すように、さまざまな濃度のペプチド変異体を添加した96ウェルプレートフォーマットを使用して収集されたデータに基づいています。同様のデータは、384ウェルおよび高密度プレートでも取得できます。しかしながら、ウェル当たりの容積が減少するので、技術的および系統的誤差、そしてその結果として、IC50 決定の精度は、ウェル密度の増加と共に低下するであろう。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig05.jpg"> 図5:単層成長LLCにおける細胞毒性アッセイからの代表的な画像。 細胞をヘキスト33342(青)およびヨウ化プロピジウム(赤)で染色した。示されている時間:10分、60分、24時間、および72時間は、化合物とのインキュベーション時間です。スケールバー = 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
モデル組織におけるレーザー光照射によるLMB002の光変換率-新鮮な豚ミンチ-をPBSに溶解したLMB002「閉環」(不活性)形態と混合したミンチ肉からなる試料を用いて測定し、この不活性形態から放射線伝播方向のLMB002「開環」(活性化)形態への変換を測定した。サンプルをシリンジに入れ、図3に示すように、片側からレーザー放射の平坦なビームを~10分間露光時間照射しました(通常、in vivo実験で使用されます)。暴露後、シリンジピストンを押し、メスで同じ高さのスライスを切断することにより、サンプルシリンダーを部分に分割しました。スライスからの抽出物中のLMB002「開環」の濃度をRP HPLCを用いて決定した。
図6は、データ解析から得られた 図6A〜D の用量効果曲線を示す。Hoechst 33342とPI色素の核共染色による死細胞の割合を特定するために、選択した測定パラメータに数値閾値を設定する組み込みの分類ツールを使用して、すべての細胞数をいくつかのカテゴリに分割しました。例えば、対照の赤チャネル(ヨウ化プロピジウム)シグナルが閾値(約110〜130単位)にある場合、細胞はPI陽性、死者と見なされる、またはPI陰性に分類され、化合物の影響を受けないと見なされます。LMB002については、化合物濃度に対するヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合のシグモイド依存性が見られる。これらのデータから、IC50 値を決定することができる。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig06.jpg"> 図6:2D培養における細胞毒性の解析。 シグモイドは、LLC培養で得られたように(A)10分間、(B)60分間、(C)24時間、および(D)72時間間隔で化合物とのインキュベーションのために取られた。フィッティングは、IC50 値(図示せず)の正確な決定を可能にする。エラーバーはSEMです。 略語:LLC =ルイス肺癌;PI =ヨウ化プロピジウム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
得られたIC50 値を考慮すると、3つの化合物すべての毒性はインキュベーション時間とともに増加したと結論付けることができます。私たちの実験では、LMB002の「開環」型は、プロトタイプペプチドであるグラミシジンSよりも約1希釈ステップで毒性が低いことが明らかになりましたが、「閉環」型は3〜4希釈ステップで毒性が低く、インキュベーション時間とともに増加します。2つの希釈ステップ間の差は、インキュベーション時間の増加によって影響されず、潜在的なライブラリスクリーニングにおいて他の化合物と比較するための実験的に決定された光線療法ウィンドウ6 として数値的に使用することができる。グラミシジンSのIC50 値は、生物学的反復における実験誤差または差動出力を補正するための基準点として設定された。
3D細胞実験では、同じタイプの生データ、つまり単一細胞で分解されたウェルあたり1枚の回転楕円体画像が生成されました。第3の染色色素としてカルセインを含めることで、代謝的に活性な細胞(グリーンチャネルで観察)の画分の定量が可能になります。384ウェルプレートを使用し、冗長な共インキュベーション時点を除外してテクニカルレプリケート数を増やし、希釈フォールドを変更することで、 図7のプレートマップに示すように、1回のテストラン(シングルプレートを使用)で複数の化合物を直接比較することができました。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig07.jpg"> 図7:2つの化合物を用いた3D培養実験のプレートマップ。 コンパウンドとコントロールのカラーコードが示されています。ウェル内の数値はμM単位の濃度であり、10分、24時間、および72時間はインキュベーション時間である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図8は、染色後に捕捉された試験済み化合物および対照スフェロイドの存在下で1スフェロイド/ウェルの密度で増殖させたLLCスフェロイドの選択されたテクニカルレプリケートの画像を示しています。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig08.jpg"> 図8:3D培養細胞毒性アッセイからの代表的な画像。 画像は、LMB002フォトフォームとグラミシジンSの両方と10分、24時間、および72時間の共インキュベーション後に、Hoechst 33342(青)、カルセインAM(緑)、およびヨウ化プロピジウム(赤)で染色された48時間齢のLLCスフェロイドを示しています。 スケールバー= 100μm。 この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig08large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
装置のソフトウェアを使用して、2D実験の場合と同様に、zスタックされた画像の山から線量効果曲線を取得しました(図9A)。さらに、3D培養におけるコンパクトで変形していないスフェロイドは、スフェロイド全体の直径によって特徴付けることができます(図9B)。また、全体のスフェロイド直径は化合物濃度によって異なることも注目された。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig09.jpg"> 図9:3D培養による細胞毒性評価。 (A)グラミシジンSと10分、24時間、および72時間共インキュベートし、染色前にキャプチャしたLLCの3D培養で得られた濃度依存性細胞毒性フィッティング曲線および(B)濃度依存性スフェロイド直径プロット。エラーバーはSEMです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ステップ2の実験では、UV検出高速液体クロマトグラフィーを使用して、両方のフォトフォーム中のLMB002濃度を測定できます。モデル組織における光変換の効率は、この設定を使用して簡単に評価および定量化できました(図3)。データは、サンプル抽出物のクロマトグラムの定量分析から得られた。これらの試験実験では、LMB002クロマトグラムを270nmおよび570nmで分光的に検出した。270 nmで、多くの追加のシグナルが観察され、モデル組織から共抽出された化合物に起因しました(化合物を含まない対照抽出物から検証されました)。両方のフォトフォームは、保持時間および吸光度において十分に異なっていた。しかしながら、LMB002の「リングオープン」シグナルは、これらのバックグラウンドシグナルからベースライン分離された( 図10Aの代表的なクロマトグラムを参照)。したがって、この信号は問題なく積分できます。570 nmでは、クロマトグラムにはLMB002の「閉環」フォームシグナルのみが含まれていました(図10B)。ここでは、RP HPLCを用いて濃度測定を行った。それにもかかわらず、LC/MSを分析法として使用すると、さらに高い精度と低い検出限界を達成できます。
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig10.jpg"> 図10:モデル組織から抽出したLMB002の代表的なクロマトグラム。 (a)照射面から2mmで試料を、270nmで記録する(LMB002「開環」形態が一体化);(b)試料は、照射面から38mmで、570nmで記録された(LMB002「閉環」のピークが積分している)。保持時間の値(表示)は、化合物の同一性をさらに確認した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図11に示すように、収集されたすべてのサンプルの対応する信号を積分した後に得られたデータを使用して、濃度-深度グラフを作成しました。これらのグラフに基づいて、モデル組織の異なる深さにおける光変換の効率を容易に評価した。これは、私たちの赤色光源が、組織サロゲートのひき肉(約103 mW / cm2)で、最大1 cの深さで「リングクローズド」LMB002光変換を誘導することを確認します。
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig11.jpg"> 図11:光変換効率評価。 モデル組織の照射面(L、mm)から異なる距離でのLMB002「リングクローズ」(非活性化、青色の点)および「リングオープン」フォーム(活性化、オレンジ色の点)の濃度(A、mg / kg)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig11large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図4に提示されたスケジュールに従って実施されたインビボ実験(方法論のステップ3)の結果は、時間の関数としての腫瘍増殖を示すグラフ(図12)およびKaplan-Meier生存曲線(図13)によって表された。
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig12.jpg"> 図12:動物における腫瘍増殖動態。 LMB002で処置した動物を、賦形動物と比較した(C57BL/6NCrlマウスにおけるLLC同種移植片モデル、化合物用量7mg/kg、IV、2時間40分間のインキュベーション、次いで650nmでの照射、100mW/cm2、20分間)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig12large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig13.jpg"> 図13:動物の死亡率曲線。 LMB002で処置した動物を、賦形動物と比較した(C57BL/6NCrlマウスにおけるLLC同種移植片モデル、化合物用量7mg/kg、IV、2時間40分間のインキュベーション、次いで650nmでの照射、100mW/cm2、20分間)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig13large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、そのような化合物の前臨床スクリーニングに使用できる光切り替え性抗癌ペプチドの評価に採用された一連の実験を提示します。これには、2Dおよび3D細胞培養における細胞毒性評価、 ex vivo(モデル組織)の光異性化効率の評価、および in vivo の有効性が含まれます。

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic ...

光制御された生物学的に活性な化合物は、可逆的に光異性化可能なフラグメント、それらの分子中に光スイッチを含む。化合物は、可逆的な光誘起電気環変換を受けるジアリールエテンフラグメントによって修飾された環状ペプチドです。それらは、光スイッチ、つまり、UVで生成された生物学的に不活性な形態と赤色光で生成された生物学的に活性な形態を切り替えることができます。光切り替え可能な薬物は、光切り替え不可能な薬物よりも安全であると考えられています。これは、無毒で不活性化された形態を人体に投与し、腫瘍、オーガー、創傷などの必要な場所でのみ光で局所的に活性化できるためです。このような光薬理学的薬物の前臨床または臨床開発のための標準的な方法やプロトコルはないので、ここでは、この初期の前臨床研究に使用できる実験を紹介したいと思います。Kateryna HorbatokとTetiana Makhniiが手順を実演します。動物の世話と実験手順は、ビエンタ社の生命倫理委員会によって承認されました。まず、標準的な手順を使用してバッファーを準備します。あるいは、市販の溶液を使用してください。化合物の原液を調製します。各コンパウンドについて、5.12ミリグラムのコンパウンドをリングクローズフォトフォームに2バッチ秤量し、2つの1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブ(1つは透明、もう1つは黒色の不透明壁)に入れます。ポジティブコントロールとして、追加のチューブで、光制御されていない親ペプチドの2.28ミリグラムを量ります。各サンプルに100マイクロリットルの純粋なDMSOを加え、30秒間ボルテックスします。透明壁チューブ内のストック溶液を、650ナノメートルのレーザー、光パワー密度6ワット/センチメートル四方の光パワー密度、ボルテックスで照射して光異性化し、混合を確実にします。色が濃い紫色から明るい茶色に変わるまで続けます。アルミホイルで光から保護してください。ウェルあたり5, 000〜10, 000個の細胞を播種する。底部が透明で壁が黒く不透明な96ウェル滅菌プレートの中央60ウェルにある200マイクロリットルのDMEMに約8, 000個のルイス肺癌細胞を使用しました。残りの36ウェルを純粋なDMEMで満たします。プレートを摂氏37度で5%CO2雰囲気中で一晩インキュベートします。翌日、化合物の段階希釈液とポジティブコントロールをポリプロピレンオートクレーブクリアプレートで調製します。DMSO中のストックから始めて、DMEMで希釈しますが、最終的な最高濃度で1%容量のDMSOを超えないようにしてください。研究対象化合物の制御されない光異性化を防ぐために、滅菌キャビネット内の照明を消してください。100マイクロリットルの希釈液を56ウェルに移し、100マイクロリットルのDMEMを予め添加して、ウェル内の化合物の必要な最終濃度(通常は5〜150マイクロモルの範囲)に到達させます。次に、ネガティブコントロールとして機能する4つのウェルに100マイクロリットルのDMEMを追加します。制御されていない光スイッチングを防ぐために、プレートをアルミホイルまたはプラスチックの不透明なカバーで覆います。選択したインキュベーション時間、プレートを摂氏37度の細胞培養インキュベーターに入れます。インキュベーション後、ウェルあたり50マイクロリットルの染色溶液をプレートに加えます。この実験の最終染色液として、5マイクロモルのヘキスト33342と1マイクロモルのヨウ化プロピジウムを使用します。摂氏37度で20分間再びインキュベートします。倍率20倍の対物レンズを使用して自動蛍光イメージングを行います。この方法のこの部分の実験室操作は、2D実験で説明したものと同じです:細胞培養の調製、試験された化合物とのインキュベーション、およびイメージング。ただし、この場合、細胞は、黒色の不透明な壁を備えた384ウェルの超低接着性のU底プレートで、コンパクトで成熟したスフェロイドとして調製されます。このサイズのプレートを使用すると、1回の実験で2つの化合物を比較することができます。本実験では、多色染色液の第3成分としてさらにカルセインAMを用いた。2D実験と3D実験の両方から得られた画像は、機器の自動画像解析ソフトウェアを使用して分析されます。Hoechst色素およびヨウ化プロピジウム色素で共染色された細胞は壊死死していると見なされ、濃度の関数としてのそれらの画分を使用してIC50値を計算します。試料照射用の光列を組み立てます。これは、レーザー光源からの光ケーブル、可変焦点距離のレンズ、不透明なカバー付きのシリンジ、およびフラットカットエンドで構成されています。その後のすべての操作は、職場の照明が最小限の暗い部屋で実行する必要があります。不活性なフォトホルマール化合物を装填したモデル組織サンプルを調製します。典型的な実行では、5グラムの新鮮な豚ひき肉を化合物のPBS溶液と機械的に混合して、1キログラムあたり50ミリグラムの最終濃度に到達します。シリンジに装填したサンプルを充填します。必要な露光と光照射時間の間、光トレインでサンプルを照射します。暴露後、ピストンでシリンジから塊を押し出し、メスで切断することにより、サンプルの厚さ4ミリメートルのスライスを作成します。化合物を計量し、アセトニトリル、水、TFA混合物、70%アセトニトリル、01%トリフルオロ酢酸で1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブで抽出します。20XGで30分間2回遠心分離して不溶性物質を除去し、上清を収集します。密閉型を570ナノメートル検出、リングオープン型を270ナノメートル検出でUV検出クロマトグラムを記録します。細胞実験でストック溶液と同様に調製した非照射および照射対照サンプルを使用して、特定の保持時間を決定し、メソッドを校正します。実験を3回繰り返し、各写真形態の正規化されたパーセントをプロット上にプロットし、照射された組織表面からの距離に対する百分率をプロットした。0日目に、体重約20グラムのC57ブラック6匹の成体雌に、右後肢の約100マイクロリットルのDMEMおよびマトリゲルミックス中の約50万個のルイス肺癌細胞の懸濁液を皮下接種する。この手順は、5%イソフルラン鎮静下で行われます。動物は、腫瘍が触知できる5〜8日目に治療の準備ができています。テストを含むすべての操作は、半暗所で実行する必要があります。この状態は、2日間複合投与を受けた後に動物を治療するときにも成り立つ。8匹の動物からなる4つのグループをランダムに組み立て、腫瘍領域から毛皮を取り除きます。2つの対照群は、ビヒクルの静脈内注射を受ける。20−グラムの動物当たり100マイクロリットルの生理食塩水、および2つの実験群の動物は、1ミリリットル当たり生理食塩水の溶液中で不活性光形態の試験化合物を受け取った。複合ボーラスを1キロあたり5ミリリットルで尾静脈に投与します。化合物を注入してから2時間45分後に、1平方センチメートルあたり100ミリワットの光パワー密度を用いて、650ナノメートルのレーザーをイソフルラン麻酔下で20分間腫瘍領域に照射する。次の30分間にわたって動物の状態を注意深く観察します。動物を毎日観察し、体重と腫瘍の大きさを測定します。腫瘍の体積を測定し、壊死の進行に注意してください。標準的な手順を使用して生存率を決定します。2D細胞培養実験の場合のステップ1のプロトコルの結果は、LMB002をさまざまな濃度でさまざまな期間インキュベーションしたルイス肺がん細胞の代表的な画像に示すように、画像として提示できます。ヘキストとヨウ化プロピジウムとの共染色により、青色チャネルの細胞核を可視化することができ、それによって総細胞数が得られます。原形質膜の完全性が損なわれた細胞が赤色チャネルで観察された。後者が壊死していると仮定すると、研究中の化合物の明らかな細胞毒性は、ヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合として定量化することができる。自動画像解析により得られたデータの定量化の結果を以下に示す。LMB002の場合、化合物濃度中のヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合のシグモイド依存性が見られる。これらのデータから、IC50値を決定することができます。私たちの実験では、LMB002のオープン型はプロトタイプペプチドであるグラミシジンSよりも約1希釈ステップで毒性が低いのに対し、クローズド型は3〜4希釈ステップで毒性が低く、インキュベーション時間とともに増加することが明らかになりました。3Dセル実験では、同じタイプの生データ、つまり壁ごとに1つのセル分解された回転楕円体画像が生成されました。第3の染色色素としてカルセインを含めることで、グリーンチャネルで観察される代謝活性細胞の画分の定量が可能になります。線量効果曲線は、2D実験の場合と同様に、Zスタックの画像の山から取得されました。パネルAはそのような曲線を示しており、2Dの結果を裏付けています。パネルBに示すように、全体のスフェロイド直径は化合物濃度によって変化する。ステップ2の実験では、UV検出の高速液体クロマトグラフィーを使用して、両方のフォトフォームのLMB002濃度を測定できます。両方のフォトフォームは、保持時間および吸光度において十分に異なっていた、図のパネルAおよびB上に集積して示されている。得られたデータを図にまとめると、赤色光源が、組織サロゲートのひき肉の最大103cmの深さでリングクローズLMB002光変換を約103ミリワット/平方センチメートルで誘導することが確認されています。我々の方法論のステップ3であるin vivo実験の結果は、Kaplan-Meier生存曲線における時間の関数としての腫瘍増殖を示すグラフによって表された。光切り替え可能な薬剤候補を評価するためのここでの戦略は実用的であり、ジアリールエテン型光スイッチを有する化合物に適しています。ステップ1、細胞毒性定量は、光制御化合物のライブラリーの初期スクリーニングに使用することができる。ステップ2、光スイッチング効率評価は、セットアップが簡単で倫理的です。生きている動物は必要ありません。ステップ3は、インビボ光薬理学モデルにおいて、小動物に適用できる療法である。

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