Name: 2光子顕微鏡を用いたマウスの胸腺のその場イメージングで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 学ぶ2光子顕微鏡を用いたマウス胸腺のその場イメージング法。新生児キメラ作成、組織分離、生細胞動態観察のプロトコルを解説。T細胞選択機構の解析に応用可能です。

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我々は技術支援のためにマットポールとジミー呉に感謝。

養子免疫伝達 1:1の最終的なドナーとホスト間の比で、人生の最初の3-7日中にインスリン注射器の2-4倍を使用して骨髄の50 - 100ulで新生児を注入する。胸骨や胸郭の下注射部位のため、しかし、腸や胃上記の目的。十分ではない穿刺ダイアフラムに注意して腹膜を貫通する針を挿入します。それは、骨髄の一部が注入中に失われることは珍しくありません。もし皮膚が徐々に針を除去、その後、拡大してできるようにするように注入されているように子犬にあなたのグリップを緩めて、損失を減らすことができます。 胸腺の解剖正中切開を行い、胸郭を明らかにするために、肌を切ったり、涙。胸骨にホールドし、腹膜と横隔膜カットスルー。胸腔を明らかにするために胸郭の側面をカット。胸腺は心臓の上部に位置しています。胸腺の構造を保つように、あなたが胸腺をばらばらにすると周囲の組織へのホールド。解剖時の乾燥からそれを維持するためにPBSで胸腺をすすいでください。ゆっくりと胸腺カプセルの表面に離れて余分な組織をいじめるし、2つの葉を二等分する。 イメージングのために組織を準備正方形のカバースリップには接着剤胸腺に獣医組織接着剤を使用します。接着剤のマイクロリットルの割合を置くことpipettemanを使用してください。胸腺のおおよその長さと幅に接着剤を広げる。カバースリップに対する胸腺安定して所定の位置にドラッグします。 二光子イメージング組織は、95％酸素、5％の二酸化炭素で灌流して37に加温するフェノールレッド℃にすることなくDMEMに浸漬され二光子励起は、スペクトラフィジックスマイタイレーザーは900nmのに合わせて調整し、CFP、GFP、YFPおよびテキサスレッド発光光はPMT検出器を使用して、515、495を使用して560ダイクロイックミラーを分離して収集された使用して達成された。

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

胸腺における二光子イメージングには、リビング、無傷の器官の相互作用および胸腺内選択イベントの根底に移行で検討することを可能にしています。

2光子顕微鏡を用いたマウスの胸腺のその場イメージングで

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

二光子顕微鏡（TPM）は、胸腺および文書胸腺細胞の開発にとって重要なイベントへの深い画像を可能にしています。胸腺細胞の群衆の中に個人の移行を追跡するには、我々は、胸腺細胞の1％未満が普遍的に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックであるドナーに由来している新生児キメラを生成する。これらの部分的な造血キメラを生成するには、新生児の受信者は、年齢の3-7日の間に骨髄を注入されています。 4-6週間後、マウスは屠殺され、胸腺は慎重に解剖され、イメージ化される組織のアーキテクチャを維持bissected。胸腺は、TPMによるex vivoでのイメージングの準備のためにカバースリップの上に接着される。撮像中に胸腺は95％酸素、5％の二酸化炭素で灌流して37に加温するフェノールレッド℃にすることなくDMEMで維持されますこのアプローチを使用して、我々は多様なT細胞のレパートリーの生成に必要なイベントを調べることができます。

我々は、新生児キメラの世代だけでなく、2光子顕微鏡によるex vivoでのイメージングのための胸腺の解剖と準備のためのステップバイステップの手順を提示する。

2光子顕微鏡法（TPM）を用いることで、胸腺深部のイメージングが可能となり、胸腺細胞の分化・成熟において重要なイベントを記録することができます。……を追跡するためには、

2光子イメージングは、単一細胞が環境と相互作用しながら移動する様子を追跡できるため、免疫学において有用です。胸腺内での移動を追跡し、2光子顕微鏡を用いることで、正選択および負選択のメカニズムを明らかにすることができます。こんにちは。カリフォルニア大学バークレー校のEllen Roby博士の研究室のIna Lottieです。そして、同じくEllen Roby博士の研究室のPaul Herzmarkです。今日は、胸腺組織のin situイメージングの方法をご紹介します。そして私が、2光子顕微鏡を用いて胸腺をイメージングする方法を実演します。それでは、2光子イメージングに至るまでの手順を説明します。これには、骨髄からの造血幹細胞の単離、新生児への骨髄細胞の養子移入、胸腺の解剖および二等分、そして2光子レーザースキャニング顕微鏡によるイメージングのための組織準備という一連の手順が含まれます。それでは、始めていきましょう。胸腺をイメージング用に準備する前に、まず新生児マウスに骨髄細胞を養子移入させる必要があります。これらの骨髄細胞は、GFPを遍在的に発現するトランスジェニックマウスの後肢から単離したものです。これは、50 µLの骨髄が入ったインスリン用注射器です。生後3日から7日のホストに対し、注入する子マウス1匹につき1頭のドナーから採取した骨髄を用いて、2回から4回の注入を行います。ここでは生後5日の子マウスを用い、注入中のマウスの動きを防ぎ、皮膚を緊張させるために、皮膚を後ろに引っ張ります。注入部位は、肺と肋骨よりも下で、腸と胃よりも上の位置を狙います。注入しながら皮膚を軽く緩め、皮膚が拡張するようにします。最後に、骨髄の喪失量を最小限に抑えるため、ゆっくりと注射器を抜きます。これらのマウスを4〜6週間育成した後、イメージングのために胸腺を摘出します。4〜6週間後、胸腺を摘出できます。イメージング用に、大型のピンセットとハサミのセット、および小型のピンセットとハサミのセットを使用します。このマウスは動物使用プロトコルに従って安楽死させ、エタノールで噴霧消毒しています。大きなピンセットで皮膚を挟み、正中線に切開を入れます。次に、ハサミで正中線に沿って切開するか、皮膚を腹膜から剥離させます。皮膚をピンで固定して胸腔を露出させます。腹膜を切開して胸腔に入る際は胸骨を保持し、横隔膜から胸腔に入った後、肋骨ケージの側面に沿って切開します。心臓のすぐ上に胸腺が位置しているのがわかります。これらを元に戻します。こちらが胸腺です。触れないようにします。小さいピンセットを使用して、胸腺の周囲の組織を保持したままにしてください。それでは、PBSで洗浄し、余分な組織の除去を開始します。胸腺を保持するために、その周囲の組織を利用します。胸腺を洗浄する際、余分な組織を慎重に切り取りながら除去していきます。胸腺には2つの葉があり、洗浄しながらこれらも分離させる必要があります。まず、胸腺の表面にあるこれらの余分な血管をすべて取り除きます。イメージングを行う胸腺の構造を壊さないよう、細心の注意を払います。そのため、表面にある組織のみを取り除いています。ここから、2つの葉をゆっくりと分離させます。分離させるのは腹側葉と背側葉で、組織を慎重に切断しながら、ゆっくりと剥がしていきます。組織の乾燥を防ぐため、PBSを少量注入します。これで2つの葉を分離しました。こちらが背側葉で、特徴的なギターのような形状をしています。そして、こちらが腹側葉です。各葉の余分な組織を取り除き、イメージング領域に不要な組織がない状態にします。ただし、保持するための組織をわずかに残しておきます。イメージングを行う際、これらの余分な組織越しに撮影することになりますが、それは本来不要であり、取り除くことで画像品質を向上させることができます。これで、イメージング用にカバーガラスへ固定する準備が整った2つの二分された葉が得られました。二分した胸腺をイメージング用に準備するには、獣医用組織接着剤と18×18 mmのカバーガラスが必要です。私はピペットマンを使用して、少量の（1 µL未満の）接着剤をカバーガラスに塗布しています。そこで、イメージングを行う胸腺の長さと同じくらいの量の接着剤を1滴落とします。そして、それを広げます。胸腺の幅と同程度になるようにし、両方の葉を同じカバーガラス上に配置します。ここにもう一つ配置します。余分な組織から葉を採取し、カバーガラスの上に置いた後、接着剤がある場所まで引き寄せます。もう一方の葉についても同様に行います。まず、手を安定させるために接着剤のないカバーガラス部分に触れさせ、その後、もう一方の胸腺葉をカバーガラスの上に配置します。両方の胸腺球をカバーガラスに固定しましたので、ここからはイメージングのためにポールに引き継ぎます。イナさん、ありがとうございました。では、このサンプルを、イメージングに使用するDME培地に浸します。こちらが、我々の2光子顕微鏡のセットアップです。2光子顕微鏡法は、胸腺の深部を観察して蛍光細胞の移動を確認できるため、免疫細胞のイメージングに非常に適しています。この手法では、パルス赤外線レーザーを用いて細胞に蛍光を発光させます。当研究室の顕微鏡には4台の異なるカメラが搭載されており、4色の同時可視化が可能です。また、20倍の特殊な対物レンズを使用しています。このレンズは、胸腺を浸漬させているDMEM培地中に浸漬させる特殊な仕様となっており、0.95 NAという非常に高い開口数を持つため、細胞を非常に明るく観察できます。組織の健全性を維持するため、DMEM培地中に95% oxygenと5% CO2をバブリングさせています。そこから灌流チャンバーへポンプで送られ、37°Cに加熱されます。ここで胸腺葉を浸漬させます。このシステムを用いることで、イメージングを行う4時間の間、胸腺内の細胞を健全な状態に保つことができます。以上で、2光子顕微鏡のイメージング設定方法について説明しました。それでは、ループ再生されているこの動画で、いくつかの結果を見てみましょう。ここでは、4つの異なる色でイメージングされた胸腺を確認できます。赤色は胸腺の血管であり、黄色は樹状細胞特異的プロモーターの制御下で黄色蛍光タンパク質を発現しているホスト由来の樹状細胞です。ここに表示されている青色と緑色の胸腺細胞は、以前Enaが説明した養子移入法を用いて新生児キメラを作製するために使用した2人の異なるドナー由来のものです。緑色の細胞は緑色蛍光タンパク質を発現している胸腺細胞であり、青色の細胞はシアン蛍光タンパク質を発現していたドナー由来の胸腺細胞です。これは以前にお見せしたのと同じループ動画ですが、これらの動画を作成するために収集したデータセットの3次元性についてお見せしたいと思います。特定の平面に焦点を合わせて画像を撮影し、次に少し深い位置に焦点を合わせて別の画像を撮影し、さらに深い位置で別の画像を撮影します。この動画では、約60 µmまで深度を下げ、その画像ボリュームの取得を約30秒ごとに繰り返すことで、動的なボリュームを得ました。また、この動画は約20分かけて撮影されました。これにより、細胞を3次元的に時間経過とともに追跡することができます。ここでは、2光子顕微鏡を用いて胸腺をイメージングする方法について説明しました。この手順において最も重要な点は、まず、新生児にドナーからの骨髄を注入することです。2つ目に、胸腺の構造を損なわないように解剖します。3つ目に、2光子顕微鏡を用いたイメージングのために、胸腺をカバーガラスにしっかりと固定します。胸腺のイメージングを行うことで、胸腺細胞の発達や多様なT細胞レパートリーの生成に関する多くの疑問を解消することができます。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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