Name: マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 学ぶマウス真皮リンパ管内皮細胞の磁気ビーズ分離法。FACS設備がない施設でも高純度で単離可能な手法で、LYVE1陽性細胞の同定とin vitro生理学研究への応用を実現します。

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この研究は、Hellenic Foundation for Research and Innovation(00376)、National Institutes of Health、National Cancer Institute(NCI)[Grant R15CA231339]、Texas Tech University Health Sciences Center(TTUHSC)School of Pharmacy Office of the Sciences助成金(CMMへ)、およびルイジアナ大学モンロー校薬学部のスタートアップ資金によって支援されました。 国立衛生研究所(NIH)は、国立総合医科学研究所[Grant P20 GM103424-21]を通じて、ルイジアナ州理事会の研究競争力サブプログラム(RCS)は、理事会支援基金(LEQSF(2021-24)-RD-A-23)(GMに)を通じて。使用される一般的なTTUHSC機器は、テキサス州がん予防研究所(CPRIT)の助成金RP190524およびRP200572を通じて入手しました。資金提供者は、研究デザイン、執筆の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。 図1A のグラフィカルアブストラクトは、BioRender.com を使用して作成されました。

マウス真皮リンパ管からの内皮細胞の単離

<ol><li>Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphatic+vasculature+in+the+21%28st%29+century%3A+novel+functional+roles+in+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease.</a> Cell. 182 (2), 270-296 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoangiocrine+signals+promote+cardiac+growth+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair.</a> Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).</li>
<li>Biswas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+in+bone+support+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury.</a> Cell. 186 (2), 382-397 (2023).</li>
<li>Tammela, T., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphangiogenesis%3A+molecular+mechanisms+and+future+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise.</a> Cell. 140 (4), 460-476 (2010).</li>
<li>Ji, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lymphangiogenesis+in+cardiovascular+diseases+and+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation.</a> Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).</li>
<li>Patnam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphangiogenesis+guidance+mechanisms+and+therapeutic+implications+in+pathological+states+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea.</a> Cells. 12 (2), 319(2023).</li>
<li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691(2015).</li>
<li>Jackson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+lymphatic+marker+LYVE-1+and+applications+in+research+into+lymphatic+trafficking+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%3A+Acta+Pathologica%2C+Microbiologica%2C+et+Immunologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).</li>
<li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ+interaction+site+in+ephrinB2+is+required+for+the+remodeling+of+lymphatic+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.</a> Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).</li>
<li>Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+roles+of+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenase+in+rat+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation.</a> Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).</li>
<li>Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+preparation+and+microscopic+analysis+of+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis.</a> Current Protocols. 2 (7), e464(2022).</li>
<li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li>
<li>Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+expression+is+negatively+regulated+by+miR-181+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells.</a> Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).</li>
<li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li>
<li>Choi, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Del-1%2C+an+endogenous+leukocyte-endothelial+adhesion+inhibitor%2C+limits+inflammatory+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment.</a> Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).</li>
<li>Mikelis, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+and+ROCK+mediate+histamine-induced+vascular+leakage+and+anaphylactic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock.</a> Nature Communications. 6, 6725(2015).</li>
<li>Schledzewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelium-specific+hyaluronan+receptor+LYVE-1+is+expressed+by+stabilin-1%2B%2C+F4%2F80%2B%2C+CD11b%2B+macrophages+in+malignant+tumours+and+wound+healing+tissue+in+vivo+and+in+bone+marrow+cultures+in+vitro%3A+implications+for+the+assessment+of+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Akwii, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2-induced+lymphatic+endothelial+cell+migration+drives+lymphangiogenesis+via+the+beta1+integrin-RhoA-formin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis.</a> Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).</li>
<li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+of+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biological functions of lymphatic vessels.</a> Science. 369 (6500), eaax4063(2020).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%3A+the+%27seed+and+soil%27+hypothesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).</li>
<li>Mellor, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+dysfunction%2C+not+aplasia%2C+underlies+Milroy+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease.</a> Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).</li>
<li>Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+primary+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of primary lymphedema.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).</li>
<li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposiform+lymphangiomatosis%3A+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatris%22%5BJournal%5D)">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).</li>
<li>Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposiform+lymphangiomatosis+and+kaposiform+hemangioendothelioma%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165(2019).</li>
<li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).</li>
<li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li>
<li>Garrafa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification%2C+and+heterogeneity+of+human+lymphatic+endothelial+cells+from+different+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues.</a> Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).</li>
<li>Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+using+primary+embryonic+mouse+lymphatic+endothelial+cells+uncover+key+roles+for+FGFR1+signalling+in+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e40497(2012).</li>
<li>Steele, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+egress+via+lymphatic+vessels+is+tuned+by+antigen+encounter+and+limits+tumor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control.</a> Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).</li>
<li>Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+age-dependent+changes+in+cell+size+on+endothelial+cell+proliferation+and+senescence+through+YAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1.</a> Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).</li>
<li>Regina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+ageing+and+endothelial+cell+senescence%3A+Molecular+mechanisms+of+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).</li>
<li>Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+sprouting%2C+proliferation%2C+or+senescence%3A+tipping+the+balance+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

リンパ系は、体の恒常性維持機能の重要な調節因子であり、最も重要な機能は、流体血漿の維持、細胞代謝副産物および毒性分子の除去、脂質吸収、および免疫細胞の輸送である1,19。適切なマーカーの同定は、リンパ学分野での新たなデータの爆発的な増加を引き起こし、リンパ管の新たな機能、例えば、特定の臓器の修復および再生能力におけるそれらの役割などを明らかにしました2,3。リンパ系に関する知識の増加は、さまざまな病理学的状態におけるその役割を描写し、以前に確立された従来の見方を変えます1。リンパ系は、がんの増殖と転移20、原発性リンパ浮腫の一種であるミルロイ病21,22、リンパ管の拡張と相互接続を特徴とするまれ...

リンパ系は、人間の生理機能において極めて重要な役割を果たしています。これは、組織と血漿液のバランスの維持、免疫監視、脂質吸収などの重要な機能を促進する重要な恒常性因子1と考えられており、心臓の修復能力2 や骨や造血の再生能力3など、最近同定された機能を促進します。リンパ系の重要な役割にもかかわらず、リンパ管の役割のいくつかの側面、および特定の生理学的パラメータと応答を支配する分子メカニズムは、とらえどころのないままです。さらに、リンパ管の血管障害は、特定の病態生理学的状態の引き金となるか、または悪化させる要因です。よく知られている例は、疾患の遺伝的起源または非遺伝的起源に応じて、それぞれ原発性リンパ腫と続発性リンパ腫ですが、原発性腫瘍の成長と転移性播種に対するリンパ系の役割は、転移の導管および免疫機能の調節因子として機能する可能性があるため、極めて重要です1。
血液血管系と比較してリンパ管の研究と知識の遅れは、主に血液血管系と比較してリンパ系の発見が遅れたことと、リンパ管特異的分子マーカーの同定が遅れることによるものです。これはここ数十年で大幅に改善され、定常状態および疾患状態のリンパ管の従来の図式の変更につながりました1。血管新生と同様に、リンパ管新生は既存のリンパ管から新しいリンパ管を形成することであり、広範囲の疾患の発症において極めて重要な役割を果たします4,5,6。しかし、血管新生とは異なり、リンパ管新生の研究は、病理モデルの発生血管形成と構造的欠陥に焦点を当てたin vivoモデルに限られてきました。リンパ管内皮細胞の単離は、in vitro研究にとって重要であり、これは提示されたプロトコルによって提供することができる。
マウスからのリンパ内皮単離のためのいくつかのプロトコルが開発されており、蛍光活性化細胞ソーティング7の使用が必要である。セルソーターの利点は、利用可能な場合、ビーズベースの単離とは対照的に、純度が高く、後者の方がより高い収率を提供することです。このプロトコールは、リンパ管内の細胞輸送に重要なリンパ内皮マーカーであるリンパ管内皮HA受容体1(LYVE-1)の発現を利用している4,8。LYVE-1の発現はリンパ管に限定され、集リンパ管には限られていないため、この技術は、すべてのリンパ管内皮細胞に均一に発現するポドプラニンなどの他のリンパマーカーとは対照的に、リンパ管からリンパ管内皮細胞を特異的に単離するのに適している9。プロトコールでは、Prox1 など、膜貫通型ではない他の重要なリンパマーカーを除外しました。
生理学的転帰はリンパ管新生であり、通常はリンパ管で開始されるため、LYVE-1はこれらの細胞での選択性があり、選択した抗体が高収量を提供したため、標的として選択されました。使用した酵素は、I型よりもコラーゲン解離に効果的であることが一般に知られているII型コラゲナーゼ10と、真皮-表皮分離に定期的に使用される広汎なプロテアーゼであるディスパーゼ11でした。しかし、組織分離のための他の酵素が報告されており12,13、使用することができる。このプロトコルの目標は、特に蛍光活性化細胞の選別が容易に利用できない場所で、磁気ビーズ精製を使用して、成体マウスのリンパ管から高収率で真皮リンパ管内皮細胞を単離する方法を説明することです。この方法は、リンパ管内皮細胞の純度がダウンストリームアプリケーションのために損なわれる可能性のあるアプリケーションに適しています。

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu;m シリンジフィルター</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 組織培養ディッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>60 mm ティッシュカルチャーディッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>FB012921</td><td></td></tr><tr><td>アニマルバリカン</td><td>ウォール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤溶液 100x</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>鈍い鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11992-20</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>細胞ストレーナー40 &mu;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー70 &mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン I、高濃度ラットテール</td><td>コーニング</td><td>354249</td><td>0.02 m 酢酸で希釈 H2O</td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-995-073</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I Solution (2,500 U/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-L 磁性粒子濃縮器</td><td>Invitrogen</td><td>120-21D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖ベース 培地 &サプリメント(LECメディウム)</td><td>R&D Systems</td><td>CCM027</td><td></td></tr><tr><td>安楽死チャンバー</td><td>Euthanex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors-Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗マウス F4/80 抗体</td><td>Biolegend</td><td>123107</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG 磁気ビーズ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>S1432S</td><td></td></tr><tr><td>LARC-A E-Z 麻酔導入チャンバー</td><td>Euthanex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads</td><td>Thermo Scientific</td><td>21356</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド溶液 4% PBS Fisher</td><td>Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-MouseLYVE-1</td><td>ReliaTech GmbH</td><td>103-PA50</td><td></td></tr>回転<tr><td>/振盪インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丸底ポリプロピレンチューブコー</td><td>ニング</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルターw0.2&mu;m ポアズ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>25-300-120</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

リンパ系は、免疫監視、脂質吸収、および組織液バランスの調節に関与しています。マウスリンパ内皮細胞の単離は、単離された細胞に対する in vitro および生化学実験の実施を可能にするため、リンパ研究にとって重要なプロセスです。さらに、Cre-lox技術の開発により、全球的に標的とすることはできませんが、組織特異的な遺伝子の欠損が可能になり、研究組織におけるそれらの役割の正確な決定につながりました。リンパ生理学および病態生理学における特定の遺伝子の役割を解剖するには、リンパ管特異的プロモーターの使用が必要であり、したがって、標的遺伝子の発現レベルの実験的検証が必要です。
野生型マウスまたはトランスジェニックマウスからリンパ管内皮細胞を効率的に単離する方法により、 ex vivo および in vitro アッセイを使用して、リンパ機能の調節メカニズムを研究し、研究されたタンパク質の発現レベルの同定が可能になります。私たちは、LYVE-1発現に基づく磁気ビーズ精製によるマウスの真皮リンパ内皮細胞(DLEC)の効率的な単離のためのプロトコルを開発、標準化、および提示しました。概説されているプロトコルは、特に蛍光活性化細胞ソーティング装置が利用できない施設において、リンパ管内皮細胞機能の重要なプレーヤーをさらに理解し、解明するためのツールを研究者に提供することを目的としています。

この方法は、タモキシフェン誘導性リンパ管内皮特異的プロ モーターProx1-CreERT2 18の影響下で、そのコード遺伝子が両方の対立遺伝子でfloxedされ、欠失した小さなGTPase、RhoAのタンパク質発現を同定するために開発されました。単離されたLECは、最大4世代にわたって培養することができ、その後、老化します。それらは凍結され、解凍され、アンジオポエチン-2で正常に刺激されました。細胞継代の数が限られているため、複数回の凍結融解サイクルは試みていません。1匹のマウスから単離した場合の典型的な細胞収量は、60 mmディッシュの40-50%のコンフルエント(~1.5 × 106 細胞)を提供し、LYVE-1ベースの精製を行うと5日後にディッシュがコンフルエントに達するため、増殖は遅くなります。
最初の精製後、LYVE-1+細胞は60 mmディッシュの15%のコンフルエントを示します(~4 × 105細胞)。2回目の精製はオプションであり、提供...

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

私たちのグループでは、内皮細胞の生理機能を調節するメカニズムを解明することに着目しています。このプロトコルは、蛍光活性化細胞の選別が利用できない施設の熱リンパ管から、特に腎内皮細胞の磁気ビーズベースの単離の方法を説明しています。このプロトコルにより、トランスジェニックマウスからリンパ管内皮細胞を単離し、in vitroでその生理機能を研究することができます。リンパ管内皮細胞の純度が下流のアプリケーションで損なわれる可能性がある場合に特に適しています。このプロセスにより、リンパ管から得られるリンパ内皮細胞が高収率で得られ、他の収集血管から得られるものではありません。また、細胞選別機能がない場合の優れた代替手段でもあります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

マウス肺樹状細胞の高度に精製された調製物が記載されている。特定の重点は、従来の樹状細胞サブセットの分離に与えられます。...

マウス肺樹状細胞の分離

このプロトコルは、濃度の単一細胞懸濁液を遠心分離し、最後に、磁気および/または目的の細胞集団のFACS選別に続いて、組織の酵素消化の異なるステップを介して、ヒト胸腺から抗原提示細胞を単離する方法を詳述する。...

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

リンパ節間質細胞の単離は、線維芽細胞網様体細胞、リンパ管および血液内皮細胞を得るための酵素消化と機械的脱凝集を含む多段階の手順です。記載された手順では、短時間の消化と自動機械的脱凝集を組み合わせて、生存リンパ節間質細胞の表面マーカーの劣化を最小限に抑えます。...

ネズミリンパ節間質細胞の単離

このプロトコルの目的は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて、ヒトのリンパ奇形嚢胞様血管および包皮を裏打ちするリンパ管内皮細胞を単離することです。その後の細胞培養およびこれらの細胞の拡大は、遺伝的プロテオミクス、機能および細胞分化の研究のための実験的な洗練の新しいレベルを可能にします。...

マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

線維芽細胞の振る舞いは、さまざまな臨床実体の根底にありますが、それらは主にその固有の不均一性のために、特徴付けられていないままです。従来の線維芽細胞研究は、in vivoでの線維芽細胞の挙動をマスキングするin...

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

このプロトコルは、栄養豊富な培地でのマウス皮膚の酵素的消化と、それに続く白血球を分離するための勾配分離について説明しています。...

酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

ここでは、マウスの皮膚から骨髄細胞を分離し、マラリア原虫のスポロゾイトの皮内注射後にリンパ節を排出するためのプロトコルについて説明します。採取した細胞のフローサイトメトリーは、寄生虫に対する皮膚およびリンパ節の炎症反応を特徴付けるための信頼性の高いアッセイを提供します。...

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

このプロトコルの目的は、説明されているマーカーを用いた肝臓内リンパ管の内皮細胞集団を識別するためにです。コラゲナーゼ IV と DNase...

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

骨格筋 (MMEC) の微小血管内皮細胞筋毛細血管の内壁の形状し、両方を規制する流体/分子と筋肉組織と血液の間 (免疫) 細胞の移行の交換。前述のように、プライマリ マウス MMEC の分離により「myovascular...

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

最近同定された頭蓋内細胞タイプである軟髄膜リンパ内皮細胞(LREC)は、機能が十分に理解されていません。この研究は、マウスからLLECを採取し、 in vitro...

軟髄膜リンパ管内皮細胞の採取と初代培養

学ぶマウス真皮リンパ管内皮細胞の磁気ビーズ分離法。FACS設備がない施設でも高純度で単離可能な手法で、LYVE1陽性細胞の同定とin vitro生理学研究への応用を実現します。

マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

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