Name: 辺縁ニッチ細胞の単離と同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぶ 辺縁ニッチ細胞の単離と同定法。ヒト角膜縁組織からRNCを分離し、シングルセルシーケンスで解析することで、幹細胞機能を支えるシグナル伝達経路を解明します。視力回復のための再生医療への応用可能性を探索します。

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本書の指導をしてくれたWei Wang氏、Lingjuan Xu氏、Rong Liu氏、資料の一部を提供してくれたYongyao Tan氏、Bihui Jin氏、Chunxiu You氏、Li Guigang氏、原稿を書いてくれたGuanyu Su氏、原稿の添削をしてくれたXiao Zhou氏、Yihong Xiong氏、Huatao Xie氏、そして完全な指導をしてくれたGuigang Li氏に感謝します。本研究は、中国国家自然科学基金会(第82070936号、81470606年、81570819年)、湖北省保健家族計画科学研究プロジェクト(第1号)の支援を受けて行われました。WJ2017M073)、同済医院のトランスレーショナルメディカル研究プロジェクトトップ10(No.2016ZHYX20)、武漢市若手医療パイオニア育成プロジェクト(No.2015whzqnyxggrc10)、グローバル人材採用プログラム(G2022154028L)、2022年湖北省国家衛生健康委員会プロジェクト(WJ2021ZH0005)、2022年湖北省財政部主題建設財団(42000022815T000000102)

50歳から60歳までのドナーからの辺縁部組織は、赤十字眼科銀行、同済病院(中国、武漢)から入手しました。この議定書は同済倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。
1. アイソレーション
<ol><li>中期角膜保存培地から辺縁部組織を採取し、超クリーンな作業台で無菌条件下で操作します。</li>
	<li>角膜の周りの虹彩と内皮を、滅菌した外科用丸い刃でこすり落とし、取り除きます。</li>
	<li>角膜と強膜の両側に1mmを残した外科用ブレードで、辺縁組織を12の等しい大きさに切断します。</li>
	<li>辺縁部組織を3.5cmの培養プレートに移し、1 mLのコラゲナーゼA(2 mg/mL、DF-12培地中)を加えて、すべての組織を浸して消化します。</li>
	<li>プレートを37°Cの細胞インキュベーターに入れ、辺縁組織を18時間消化します。 注意: フォローアップ手順は通常、2日目に実行されます。</li>
	<li>5%基底膜マトリックス(マトリゲル)でコーティングされた6ウェル培養プレートを調製します。<ol><li>ウェルの底に5%基底膜マトリックス(MESCMに溶解[表1])をコーティングします。</li>
		<li>200 μL と 1 mL チップ、15 mL 遠心チューブ 1 本、6 ウェルプレート 1 枚を滅菌バッグに入れて調製します。</li>
		<li>滅菌したバッグ(チップと遠心チューブを含む)と新しい6ウェルプレートを-20°Cまたは-80°Cの環境で20分間置きます。基底膜マトリックスを冷蔵庫で4°Cで解凍します。</li>
		<li>-20°Cまたは-80°Cの環境から予冷したチップ、遠心チューブ、6ウェルプレートを取り出し、ウルトラクリーンワークベンチで以下の操作を行います。</li>
		<li>200 μL チップを使用して 5% 基底膜マトリックス 50 μL を 1 mL MESCM に移し、穏やかかつ均一に混合します。</li>
		<li>予冷した 1 mL チップを使用して、5% 基底膜マトリックス(MESCM に溶解)を 6 ウェル培養プレートの 1 つのウェルに移します。</li>
		<li>6ウェルプレートを静かに水平に振とうし、6ウェル培養プレートを37°Cの細胞インキュベーターに約1時間入れてから、次のステップを実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>18時間消化後、コラゲナーゼA消化された辺縁組織を取り出すと、目に見える小さな塊と未消化の強膜組織のみが残ります。 注:高倍率顕微鏡では、多くの高密度に充填された細胞(LNCを含む)で構成されるクラスターが明らかになります。</li>
	<li>200 μLのピペットチップを使用して、実体顕微鏡下で未消化の強膜組織からクラスターを剥離します。</li>
	<li>クラスターを3.5cmの培養プレートに移し、0.25%TEに浸漬してから、プレートを細胞インキュベーターに15分間入れます。</li>
	<li>1 mL MESCM と 10% ノックアウト血清を添加して細胞消化を停止し、1 mL のピペットチップを使用してクラスターを個々の細胞に再懸濁するために、静かに上下にピペットで移動します。</li>
	<li>細胞懸濁液を 15 mL 遠心チューブに移し、200 x g で 5 分間遠心分離します。</li>
	<li>細胞沈殿を妨げずに上清を慎重に除去し、1 mL MESCM を添加して細胞を再懸濁します。</li>
	<li>1 mLのピペットチップを使用して、下部の細胞沈殿物がMESCMに均一に懸濁するまで2〜3回ピペットを上下させ、20 μLの細胞懸濁液を採取して細胞をカウントします。</li>
	<li>細胞懸濁液を 1 mL のピペットチップで 5% 基底膜マトリックスコーティング 6 ウェルプレートに移し、MESCM の容量を 2.5 mL に増やします。</li>
	<li>6ウェルプレートを水平に静かに振とうし、細胞を均等に分散させます。</li>
	<li>細胞を画像化して記録した後、培養インキュベーターに移します。細胞を毎日観察して写真に撮り、3〜4日ごとに培地を交換します。</li>
</ol>2. LNCの識別
<ol><li>免疫蛍光染色<ol><li>1 mL 0.25% TE を使用して 37°C のセルインキュベーターで 5 分間、プレートの底部から LNC を消化します。</li>
		<li>1 mL MESCM(ノックアウト血清を含む)を添加して消化を終了し、細胞懸濁液を 200 x g で 5 分間遠心分離し、上清を注意深く吸引します。</li>
		<li>1 mL の MESCM を加えて、細胞を懸濁液に再懸濁します。80 μLの細胞懸濁液(スライドあたり4×103 細胞)を4枚のスライド(20 μL/スライド)用に調製し、遠心分離システムを使用して、メーカーの指示に従って細胞を顕微鏡スライドに沈着させます。</li>
		<li>4%パラホルムアルデヒドで細胞(ステップ3でスライドに接着)を約10分間固定した後、0.2% Triton X-100 in PBSで15分間スライド上の細胞を透過処理します。</li>
		<li>2%ウシ血清アルブミン(BSA)で細胞を1時間ブロックしてから、一次抗体(Pan-CK [1:1000]、Vim [1:100]、CD90 [1:100]、CD105 [1:200]、SCF [1:100]、PDGFRβ [1:100])と4°Cで一晩インキュベートします。 インキュベーション後、スライドをPBST(PBS + 0.1% Tween 20)で洗浄(5分/回、3回)して、結合していない一次抗体を除去します。</li>
		<li>対応する二次抗体(ロバ抗マウスIgG二次抗体TRITC [1:1000]、ロバ抗ウサギIgG FITC [1:500]、ロバ抗マウスIgG 488 [1:300]、ロバ抗ウサギIgG 594 [1:400])を適切なIgG非特異的IgG抗体と1時間インキュベートします。PBST(5分/洗浄、3回)を使用して、結合していない二次抗体を除去します。</li>
		<li>核を 5 μg/mL DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)で対比染色し、スライドを密封します。</li>
		<li>蛍光顕微鏡(倍率400倍;ばく露時間: 50 ms)。</li>
	</ol></li>
	<li>定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)<ol><li>RNA Isolation Kit を使用して、製造元の指示に従って全 RNA を抽出します。</li>
		<li>大容量cDNA転写キットを使用して、1〜2μgのトータルRNAをcDNAに逆転写します。</li>
		<li>cDNA(100 ng)、TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL)、ユニバーサル PCR マスターミックス (10 μL)、ddH 2 O (20 μL まで) を含む 20 μL 溶液中で、逆転写 (42 °C、2分、50 °C、85 分) および qPCR (95 °C、5 分、95 °C、10 秒、40 サイクル) を実行します。</li>
		<li>比較CT法(ΔΔCT)4,9を用いて、相対的な遺伝子発現を調べます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. LNCの特性評価
<ol><li>細胞カウント(血球計算盤)<ol><li>プレートの底部から0.25%TEを用いて、37°Cの細胞インキュベーターで5分間LNCを消化します。</li>
		<li>1 mL MESCM(ノックアウト血清を含む)を添加して消化を終了し、細胞懸濁液を 200 x g で 5 分間遠心分離し、上清を注意深く吸引します。</li>
		<li>1 mL の MESCM を加えて細胞を再懸濁し、0.5 mL の遠心チューブで 10 μL の細胞懸濁液を採取します。等量の0.4%トリパンブルー染色溶液を加えます。</li>
		<li>染色した細胞懸濁液10 μLを血球計算盤の計数領域に置き、計数用のカバースリップで覆います。 注:中央の5つの正方形の領域のセル数は「A」として定義されます。1 mLの細胞数は、5A × 104 × 2として計算されます。</li>
	</ol></li>
	<li>フローサイトメトリーによるLNCおよびBMMSCマーカーの検査15<ol><li>フローサイトメトリー15(2-4 × 106イベント/サンプル、各サンプルから2,000個の細胞が得られ、同時にゲーティングされた合計550,000個の細胞)を使用して、LNCおよびBMMSCにおけるSCF、CD73、CD90、およびCD105の発現を検出します。</li>
		<li>キットの説明書に従って、ブロッキングバッファー(3% BSAおよび0.05% Tween-20 in PBS)中で細胞を採取し、染色します。</li>
		<li>フローサイトメーターを用いた蛍光活性化セルソーティング(FACS)解析を実施します。本研究では、FACS DivaソフトウェアとFlowJoソフトウェアを使用した。サンプルごとに 10,000 個のイベントを記録し、生細胞をゲートして解析します。</li>
	</ol></li>
</ol>

ヒト辺縁ニッチ細胞を分離、培養、および同定するためのプロトコール

<ol><li>Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of limbal stem cell deficiency.</a> Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).</li>
<li>Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+from+limbal+stroma+of+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.</a> Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+limbal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+potential+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+lacrimal+canaliculus+epithelial+stem+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+regenerative+potential+of+corneal+stromal+stem+cells+and+their+secretome+after+long-term+storage%3A+Implications+for+ocular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).</li>
<li>Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+isolation+of+limbal+niche+cells%3A+Maintenance+of+limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+and+three-dimensional+matrigel-induced+dedifferentiation+of+mature+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+biopsy-derived+stromal+stem+cells+prevent+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring.</a> Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).</li>
<li>Acar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allogeneic+limbal+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+corneal+healing%3A+role+of+administration+route%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route.</a> Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).</li>
<li>Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+limbal+fibroblasts+and+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+to+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells.</a> Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).</li>
<li>Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+limbal+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells.</a> Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+attract+stromal+niche+cells+by+SDF-1%2FCXCR4+signaling+to+prevent+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation.</a> Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+niche+cells+are+a+powerful+regenerative+source+for+the+prevention+of+limbal+stem+cell+deficiency+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.</a> Scientific Reports. 8, 6566(2018).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
<li>Pineda, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPineda%2C+R+%22World+Corneal+Blindness.+Foundations+of+Corneal+Disease%22">World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease</a>. , Springer, Cham. 299-305 (2020).</li>
<li>Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li>
<li>Resnikoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year 2002.</a> Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+bio-engineered+tissue+employing+3D+nanofiber-aerogel+scaffold+to+facilitate+LSCs+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration.</a> Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).</li>
<li>Aghamirsalim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+hydrogels+for+ocular+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">3D printed hydrogels for ocular wound healing.</a> Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).</li>
<li>Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+the+corneal+epithelium+using+limbal+stem+cells+or+alternative+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).</li>
<li>Rohaina, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+limbal+stem+cell+deficient+corneal+surface+with+induced+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+on+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane.</a> Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).</li>
<li>O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosa+tissue+equivalents+for+the+treatment+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency.</a> Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).</li>
<li>Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells.</a> Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).</li>
<li>Zeppieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+corneal+wound+healing+after+laser-induced+corneal+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice.</a> Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).</li>
<li>Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+cues+modulate+the+neurogenic+potential+of+bone+marrow+and+dental+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells.</a> Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+generation+of+multiple+ocular-like+cell+lineages+and+fabrication+of+functional+corneal+epithelial+cell+sheets+from+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells.</a> Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+are+a+potent+resource+of+adult+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+between+limbal+niche+progenitors+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).</li>
<li>González, S., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+native+limbal+stromal+cells+increases+the+expansion+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture.</a> Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).</li>
<li>Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6+expression+identifies+progenitor+cells+for+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes.</a> FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).</li>
<li>Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+limbal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the limbal stroma.</a> Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).</li>
<li>Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+limbal+progenitor+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).</li>
</ol>

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角膜の透明性は、通常、角膜間質における小さな線維(直径25〜30 nm)の規則的な配置と分布によって維持され、これは正常な視力に不可欠です16。世界には2億5,300万人の視覚障害者がおり、そのうち3,600万人が17歳の視覚障害者です。世界保健機関(WHO)は、角膜失明を人間の視力に対する最も深刻な危険の1つと見なしており、世界の全失明の5.1%を占めています16。正常なCESの角膜上皮欠損症は、瘢痕を残さずに迅速に治癒することができます18。世界中で1,270万人以上の患者が、中等度から重度の視力低下のために角膜移植を必要としていると推定されています19。角膜移植失敗の30%はCESD20によって引き起こされました。しかし、世界のほとんどの国で角膜提供が不足しているため、最終的に角膜移植を受けることができたのは、角膜失明患者の70人に1人だけでした<...

角膜上皮幹細胞欠損症(LSCD)1、角膜上皮再生症(CES)の発生率は、角膜感染症や外傷によりますます緊急性を増しています。適切に治療しないと、CESDは角膜移植を必要とする失明につながる可能性があります。その結果、CESの再生はより重要になってきています。辺縁ニッチ細胞(LNC)と呼ばれる支持細胞のグループがあり、CES機能に不可欠なサポートを提供します。辺縁間質幹細胞は、Polisettyらによって最初に単離され2、Xieら3によって、辺縁の下皮および辺縁の間質に局在するLNCとして同定されました。LNCは角膜縁を支える幹細胞であり、骨髄由来MSC(BMMSC)の機能を持ち、角膜上皮細胞や角膜間質細胞などに成長を誘導する可能性があります3,4,5,6,7。これまでの研究で、LNCの幹細胞の質は、すでに臨床で広く使用されているBMMSC8よりも原始的であることが示されました。LNCは、特にCESDの治療において、MSCに次ぐ実行可能な選択肢になる可能性さえあります。CESの重要な支持細胞であるLNCは、辺縁部の「ニッチ」構造に由来する幹細胞でもあります。LNCは、成熟角膜上皮細胞(MCEC)のCES9への脱分化に重要な役割を果たす可能性があります。しかし、LNCに関する研究はまだ比較的不十分であり、LNCの用語、単離、精製、同定、および特性に関するコンセンサスはありません。一部の研究者は、LNCを辺縁生検由来間質幹細胞10、辺縁間葉系幹細胞11、辺縁線維芽細胞12、および辺縁間葉系間質細胞13と名付けました。LNCの増殖特性は詳細に記述されておらず、科学的および臨床的応用が有望であり、将来的に最も重要な臨床ツールの1つとなる可能性があるため、LNCの単離、精製、同定、および特性を要約する必要があります。
以前の研究14によると、LNCは主に辺縁の下皮と辺縁の間質に存在します。このプロトコルには、コラゲナーゼAを使用して辺縁組織を処理し、LEPCとLNCからなるクラスターを取得し、0.25%トリプシンEDTA(TE)で単一細胞に消化することが含まれます。次いで、LNCを改変胚性幹細胞培地(MESCM)で選択的に培養し、精製した。この論文で報告されているプロトコルは単純で、ヒトLNCを大量に入手するのに高い効率を持っています。
LNCの単離、培養、同定の詳細な手順は、LNC研究に関心のある科学者のためにビデオに記録されており、必要に応じて便利に繰り返すことができます。

<table><tbody><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインド</td><td>ールサーモフィ</td><td>ッシャーD1306</td><td>5&mu;g/mL</td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>シグマ</td><td>V900919</td><td>1.25 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>抗 CD73</td><td>Abcam</td><td>ab202122</td><td>1:50</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>MERCK</td><td>A1933-CD105</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Proteintech</td><td>67075-1-Ig</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Abcam</td><td>ab114052</td><td>1:50</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Proteintech</td><td>66766-1-Ig</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Abcam</td><td>ab307736</td><td>1:50</td></tr><tr><td>セルインキュベーター</td><td>Shanghai Lishen</td><td>K1119K4644</td><td>HF90(HT)</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>StatSpin&nbsp;</td><td>StatSpin CytoFuge</td> <td>12-Collagenase</td></tr> <tr><td>A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>LSM700</td><td>-</td></tr><tr><td>培養プレート</td>ビ<td>リヤ</td><td>3500356</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)&nbsp;</td><td>cytiva</td><td>SH30023.01</td><td>90%</td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG (H + L) 二次抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>A16016</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG (H + L) 二次抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>31568</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>FACS Diva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td>Tree</td> <td>Star-Flow</td></tr> <tr><td>Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>Becton Dickinson LSRII</td><td>-</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>olympus</td><td>cx31&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Σ</td><td>G1914</td><td>50 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>MERCK</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr><tr><td>大容量cDNA転写キット</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>倒立位相差顕微鏡</td><td>&nbsp;UOP</td><td>DSZ2000X</td><td></td></tr><tr><td>ITS(インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム)</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>5 &mu;g/mL インスリン、5 &mu;g/mL トランスフェリン、5 ng/mL 亜セレン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>KnockOut SR Serum Serum Replacement for ESCs/iPSCs</td><td>gibco</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BioCoat</td><td></td> <td>356234-Pan-CK</td></tr> <tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>NoninBio</td><td>NBS0135</td><td>4.00%</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>MKBio</td><td>MM-1505</td><td>4%</td></tr><tr><td>PDGFR&beta;</td><td>Abclonal</td><td>A1444</td><td>1:100</td></tr><tr><td>リアルタイム蛍光定量PCR装置</td><td>Applied Biosystems</td><td>Step One Plus</td><td>-</td></tr><tr><td>組換えヒトFGF-ベーシック</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>4 ng/mL</td></tr><tr><td>Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>RNeasy Mini RNA Isolation Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>-</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Bioss</td><td>bs-0545R</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Abcam</td><td>ab52603</td><td>1:50</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td></td></tr><tr><td>滅菌外科用丸刃</td><td>Careforde</td><td>29500</td><td>サイズ 10</td></tr><tr><td>TaqMan 遺伝子発現アッセイ ミックス</td><td>Applied Biosystems</td><td>4448489</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MERCK</td><td>X100</td><td>0.20%</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>0.40%</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>P9416-Ultra</td><td></td></tr> <tr><td>Clean Bench</td><td>LaiTe</td><td>LT20200705</td><td>SW-CJ-IFDG</td></tr><tr><td>ユニバーサル PCR マスターミックス</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Vim&nbsp;</td><td>アブカム</td><td>ab92547</td><td>1時100</td></tr></tbody></table>分

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

ここでは、辺縁ニッチ細胞(LNC)の単離と同定のための標準的な手順を報告します。アイバンクから得られた辺縁部組織をLNCの単離に使用しました。組織を無菌条件下で12個に分割し、コラゲナーゼAを使用して細胞培養インキュベーターで37°Cで18時間消化し、LNCおよび辺縁上皮前駆細胞を含む細胞クラスターを得ました。細胞クラスターを0.25%トリプシン-EDTAを用いて37°Cで15分間消化し、単一細胞を得た後、5%マトリゲルでコーティングされたプラスチック表面上の改変胚性幹細胞培地(MESCM)で培養しました。細胞は70%のコンフルエンスで継代し、免疫蛍光法、リアルタイム定量PCR(qPCR)、およびフローサイトメトリーを用いてLNCを同定しました。一次LNCを単離し、12回以上継代した。P4からP6にかけてのLNCの増殖活性が最も高かった。LNCは、BMMSC(SCF、Nestin、Rex1、SSEA4、CD73、CD90、MSX1、P75NTR、およびPDGFRβ)よりも高い幹細胞マーカーを発現していました。さらに、P4 LNCはVIM、CD90、CD105、PDGFRβを均一に発現するが、LNCの同定マーカーとして使用できるPan-CKは発現しないことが示された。 フローサイトメトリー解析では、LNCの約95%、97%、92%、および11%がそれぞれCD73、CD90、CD105、およびSCFを発現し、BMMSCでは68%、99%、20%、および3%であることが示されました。LNCの単離と同定のための標準的なプロセスは、LNCを広く使用するための信頼できる実験室基盤を提供する可能性があります。

LNCの成長 LNCは、上記のように、角膜強膜縁組織のコラゲナーゼA(2 mg/mL)消化の消化法に従って正常に単離されました(図1)。以前に報告された研究3と同様に、コラゲナーゼA消化後、イモムシのようなクラスターが顕微鏡下で可視化されました(図2)。紡錘体細胞の割合は、細胞の継代とともに徐々に増加しました。紡錘形の細胞は、コーティングされた基底膜マトリックス3のないプラスチックで培養された対応する細胞とは異なり、コーティングされた5%基底膜マトリックスプレートで増殖する可能性があります。P1からP12までの細胞は均一な増殖速度を示し、細胞倍加時間は2〜7日でした(表2)。本研究では、LNCを13継代、34倍に培養しました(図3)3。LNCは初...

ここでは、ヒトの辺縁ニッチ細胞を単離して同定するためのプロトコルを紹介します。

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

私たちの研究は、辺縁幹細胞欠損症を治療し、患者の視力を回復するために、辺縁ニッチの再構築に焦点を当てています。私たちは、辺縁ニッチ細胞が辺縁幹細胞の機能を支える重要な細胞であるのかどうか、もしそうなら、それがどのように機能するのかを解明しようとしています。最近の研究では、骨髄からの間葉系幹細胞の結膜下移植により、アルカリ焼けした眼の辺縁幹細胞欠損症が予防されることが報告されています。現在、私たちの研究を進めるために使用されている技術の1つは、辺縁ニッチ細胞の特性評価のために単一の細胞レベルで主要なシグナル伝達経路の活性を解析できるシングルセルシーケンシングです。LNCは将来的に重要な臨床ツールになる可能性を秘めていますが、その成長特性はあまり詳細に検討されていません。それらの有望な科学的および臨床的応用を考慮すると、LNCの単離、精製、同定、および特性を要約する必要があります。

isolation-and-identification-of-limbal-niche-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

私たちは、細胞の挙動を研究する中でエレクトロスピニング膜内micropocketsを製造するための技術を報告している。具体的には、マイクロ光の組み合わせを記述し、微小特徴を備えたPLGA（ポリ（ラクチド - コ - グリコリド））角膜の生体材料デバイスの製造のためのエレクトロスピニング。...

角膜再生のためのニッチを装備膜を製造するためのマイクロ光とエレクトロスピニングの組み合わせ

この記事では、R26R-Confettiマウスを使用した多色系統追跡実験を設計し実行するための原理について説明します。私たちは、他の関心のある組織に修飾できる角膜上皮細胞を追跡するための特定のプロトコルを提供します。...

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

ヒトの糖尿病臓器培養角膜におけるアデノウイルス遺伝子治療の例が、これらの角膜における創傷治癒の遅延と上皮幹細胞マーカー発現の顕著な減少の正常化に向けて提示されています。また、幹細胞が豊富な辺縁系上皮培養におけるこのプロセスの最適化についても説明します。...

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

次の記事では効果的に輪部幹細胞欠損（LSCD）の持続可能なマウスモデルを作成する簡単な、再現可能な技術を提供します。この動物モデルで試験し、輪部幹細胞疾患の治療の有効性を比較するのに有用です。...

マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

露出した正常眼球表面は、角膜および結膜からなる。上皮細胞、杯細胞および免疫細胞が結膜内に存在する。ここでは、非侵襲的な印象細胞学の技術が印象細胞学装置とフローサイトメトリーを用いて結膜内の免疫細胞を分析することが記載されている。...

結膜から細胞を単離して表現する非侵襲的方法

このプロトコルは、xeno ・ フィーダー細胞フリー培養条件下でのひと多能性幹細胞から角膜輪部上皮幹細胞の差別化のための単純な 2...

効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化

涙腺 (LG) は、α平滑筋アクチン (αSMA): 筋上皮細胞 (MECs) および周皮細胞を発現する2つの細胞型を有する。MECs は外胚葉の起源であり、多くの腺組織に見られる一方、周皮細胞は endodermal 起源の血管平滑筋細胞である。このプロトコルは、マウス LGs から MECs...

成人ネズミ涙腺および顎下腺からの筋上皮細胞の単離

ここでは、微生物学的手法とMALDI-TOF質量分析によるその後の同定を用いたユニークな眼綿棒および培養ベースの濃縮ステップを用いた有酸素性および気性嫌気性マウスの結合性のコンメンサルト菌の分離と増幅のためのプロトコルを提示する。...

マウスにおける結膜経月の分離と同定

マウスモデルにおけるパンチトレフィン法を用いた角膜および辺縁部のアルカリ損傷誘導

私たちは、角膜上皮の掻爬術と角膜縫合糸の組み合わせにより、重度の角膜炎症のラットモデルを開発しました。この研究では、炎症条件下での角膜の炎症パターン、上皮の増殖、および辺縁系幹細胞の変化を評価しました。...

角膜上皮掻爬術と角膜縫合糸の併用に基づくラットにおける重篤な角膜炎症モデルの確立

ここでは、コラーゲンAとトリプシンを用いた逐次消化を通じて、マウス全角膜から高品質な単細胞懸濁液を得るプロトコルを紹介します。この方法は高いRNA完全性を持つ生存可能な単一細胞を生成し、単一細胞RNAシーケンシングやフローサイトメトリyなどの後続応用にも適合します。...

マウス角膜からの単細胞懸濁液採取プロトコル

学ぶ 辺縁ニッチ細胞の単離と同定法。ヒト角膜縁組織からRNCを分離し、シングルセルシーケンスで解析することで、幹細胞機能を支えるシグナル伝達経路を解明します。視力回復のための再生医療への応用可能性を探索します。

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

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