Name: 成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶ 成体自己免疫性脳脊髄炎マウスから主要な中枢神経系常在細胞型を同時単離する方法。ミクログリアやオリゴデンドロサイトなどを一頭のマウスから高純度に分離し、神経炎症における細胞動態と分子メカニズムを正確に解析できます。

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自己免疫マウスからすべてのCNS常在細胞型を同時に単離

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

これまでのところ、質量分析とRNAシーケンシングを組み合わせて生体外でCNSに常在する細胞をマッピングする方法は、健康と疾患における非常に正確な細胞プロファイリングを提供しますが、この分野での野心的な技術的知識と専門知識が必要です50,51。さらに、機能解析ができず、非常に高価です。それに加えて、マイクロ流体ブレインオンチップシステムは、疾患メカニズムの迅速かつ手頃な価格のスクリーニングと、細胞の成長と移動を制限した新しい治療アプローチのテストを提供します52,53,54,55。また、中枢神経系オルガノイドは、将来、疾患経過中の細胞モデリング、細胞間接続、および相互作用の研究において、同等の代替手段となる可能性があります56,57,58,59。しかし、蛍光活性化および磁気活性化細胞選別は、現在、ex vivo 35,60,61で純粋で生存可能な単一細胞懸濁液を生成するための最も効果的な方法です。中枢神経系常在細胞型の単離のための他の確立された製造プロトコルが、磁気単離および先行細胞解離の個々のステップに関して類似している場合でも、それらは各細胞型に対して個別に実施されることを意図している。対照的に、現在のプロトコルでは、CNS常在細胞タイプごとに異なる単離法を論理的なコンテキストに統合しているため、一度に、1つのCNS細胞懸濁液から同時に実行できます(表1、表2)。これにより、1つのCNS細胞懸濁液からのマルチオミクス解析が可能になり、最終的には複雑な神経回路網の探索が可能になります。このプロトコルを実行するために複数の動物から複数の組織をプールすることが必須でなくても、このプールにより、さらなる下流分析のために十分な数の単離された細胞が確保されます。単一細胞型の単離に異なるマウスを使用すると、潜在的な細胞相互作用を解析する可能性が排除されます。さらに、以前のCNS解離に続く異なるCNS細胞タイプに対して個別の単離法を組み合わせることで、その後のすべての磁気分離ステップに1つの解離中枢神経系細胞懸濁液を使用することで、材料費を節約できます。さらに、異なるマウスの使用によって引き起こされる潜在的な技術的バイアスが最小限に抑えられます。
このプロトコルの限界の1つは、雌のC57BL/6Jマウスをほぼ独占的に使用できることです。EAE免疫プロトコルは雌マウス用に設計および確立されているため、この細胞単離プロトコルは雌のC57BL/6Jマウスにも実装されました。それにもかかわらず、ナイーブな雄マウスは、このプロトコルの開発中にも使用され、結果として生じる細胞数または純度への影響を認識しませんでした。別の制限は、正の選択の観点からニューロンを単離するための特定のマイクロビーズが存在しないため、ニューロンの磁気細胞の分離に影響を与えます。純粋な単一細胞懸濁液は、ビオチン標識とすべての非神経細胞の枯渇によって得られると想定されました(表2)。この仮定は、ニューロンの特異的核マーカーとしてNeuNを使用することによって検証され、前述のフローサイトメトリー純度パネルに統合されました。別の制限は、EAEマウスにおけるミクログリアの単離に関するものである。ここで、結果として得られる細胞収量は、MACSプロトコルの後に追加のソーティングステップがあるため、他の細胞タイプと比較して減少します。さらに、選別は他の細胞集団と比較してミクログリアの機械的ストレスを増加させると主張することができます。個々の選別戦略により、細胞収量が異なる場合があります。単離された細胞数が予想または望ましいものよりも少ない場合は、ゲーティング設定を調整するか、生死識別を改善することをお勧めします。
プロトコルの重要なステップは、デブリの除去です。グラジエントを非常にゆっくりと緩やかに層状にして、必要な 3 つの別々の相を作成する必要があります(図 2A)。2つのトップフェーズのミエリンやその他のデブリ残渣が完全に除去された場合にのみ(図2E)、純粋な単一細胞懸濁液を生成し、さらなる汚染を減らすことができます。得られた細胞懸濁液が純度を欠いている場合、これはおそらく、すべてのマイクロビーズの正しい使用の保証の次に最初に改善されるべきプロトコルのセクションです。
このタイプの実験では、高レベルの純度と生存率を得ることが困難な場合があります。トラブルシューティングの推奨事項は次のとおりです。
-無菌条件下での作業は、さまざまなマイクロビーズの汚染を防ぎ、特にその後の培養で繰り返し使用できるようにするために義務付けられています。 -取り違えを防ぐために、各チューブにラベルを付けることを強くお勧めします。 -非冷却の試薬/緩衝液の使用は避けてください。高い生存率を確保するために、実験全体を通してすべての細胞懸濁液を氷上に保管してください。 -異なる作業ステップ間の時間をできるだけ短くしてください。プロトコルには、実験の一時停止が推奨される特定の部分はありません。 -指定された潜伏期間を遵守することは非常に関連性があります。
結論として、1つのCNS複製からすべての主要なCNS常在細胞タイプを同時に分離するためのこの現在のプロトコルは、1つのCNS細胞懸濁液から複雑なニューロンネットワークと神経炎症経路を ex vivo で分析する可能性を提供します。したがって、中枢神経系に常在する細胞は、EAEにおける神経炎症、神経変性および/または寛解期など、疾患経過のさまざまな段階で調査することができます。さらに、細胞間相互作用や生化学的経路を個人レベルで研究することができ、実験グループ内のばらつきを減らすことができます。また、単離されたCNS細胞の画分を単離培養で培養し、さらなる機能アッセイと検証を行う機会もあります。このプロトコルは、前臨床および臨床研究のアプローチに影響を与える可能性のある大きな進歩を提供します。

多発性硬化症(MS)は、脱髄、軸索損傷、神経膠症、神経変性を特徴とする中枢神経系(CNS)の慢性炎症性自己免疫疾患です。この分野では数多くの研究アプローチが行われているにもかかわらず、多発性硬化症の病態生理学はまだ完全には理解されていません1,2,3,4。多発性硬化症を調査するための最も一般的な動物モデルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(MOG35-55)誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)であり、その臨床的および病態生理学的特徴の多くを共有しています5,6,7,8,9.これは、炎症、脱髄、および神経軸索変性につながるCNS特異的抗原に対する免疫系の応答に基づいています。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、MSに見られる神経炎症経路とシグナル伝達カスケードの調査に適したモデルです。
多発性硬化症に対する現在の治療法の選択肢は部分的にしか効果がなく、主に疾患の初期炎症期に焦点を当てています。しかし、多発性硬化症の神経変性成分は、長期的な治療アプローチにとって大きな課題であるようです。したがって、自己免疫疾患の分子および細胞メカニズムを包括的に研究するには、再現性のある正確な細胞単離プロトコルが必要です。10,11,12,13,14,15の単一細胞タイプを単離するためのプロトコルがいくつか存在したとしても、複数のCNS常在細胞集団を一度に同時に単離するニーズは満たされていません。中枢神経系常在細胞の単離に関する以前のプロトコルは、細胞の機能性と純度の維持に欠けており、隣接する細胞との共培養16,17,18または細胞内ネットワークex vivo19,20,21,22の複雑な分析には適していません。
このプロトコルの目的は、成人の健康なマウスとEAEマウスに適用可能なすべての主要なCNS常駐細胞タイプの純粋で生存可能な単一細胞懸濁液を同時に分離するための再現性のある包括的な方法を確立することでした。異なる細胞タイプは、磁気活性化セルソーティング(MACS)を用いて単離した23。細胞分離は、ポジティブセレクション、すなわち細胞タイプ特異的な表面マーカーの磁気標識、またはビオチン化とすべての望ましくない細胞の枯渇によるネガティブセレクションのいずれかによって達成できます。フローサイトメトリーを適用して、単離された単一細胞懸濁液の純度が90%を超え、生存率が少なくとも80%であることを確認しました。
結論として、主な目標は、健康なマウスとEAEマウスにおける複雑な細胞ネットワークと生化学的シグナル伝達カスケードの包括的かつ正確な分析を提供する神経炎症経路の調査のための汎用性の高いツールとして、すべての主要なCNS常在細胞タイプを同時に分離するためのプロトコルを確立することでした。

<table><tbody><tr><td>70 &mu;m cell strainers</td><td>Corning, MA, USA</td><td>352350</td><td>CNS tissue disssociation</td></tr><tr><td>ACSA-2 抗体, 抗マウス, PE-Vio 615 (clone REA-969)</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-116-244</td><td>フローサイトメトリー, 4°C;C</td></tr><tr><td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-107-677</td><td>Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P at arrival and save them at -20 >C;残りのキットは4°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-097-678</td><td>MACS of astrocytes, store at 4 > (4 °Cで保存)C</td></tr><tr><td>抗マウスCD16/32抗体&nbsp;</td><td>BioLegend, London, UK</td><td>101301</td><td>フローサイトメトリー, 4°C;C</td></tr><tr><td>Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-094-543</td><td>MACS of oligodendrocytes, store at 4 > (オリゴデンドロサイト)C</td></tr><tr><td>AstroMACS 分離バッファー</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-091-221</td><td>アストロサイトのMACS, 4 >C</td></tr><tr><td>ビオチン抗体、PE(クローンBio3-18E7)</td><td>Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、NRW、ドイツ</td><td>130-113-853</td><td>フローサイトメトリー、4°で保存;C</td></tr><tr><td>BRAND Neubauer 計数室</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>10195580</td><td>Cell counting&nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 抗体 (clone 30-F11)</td><td>BioLegend, London, UK</td><td>103137</td><td>Flow cytometry, store at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>CD11b MicroBeads, ヒト, マウス</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-049-601</td><td>ミクログリアのMACS, 4 >C</td></tr><tr><td>DNAse I, recombinant, Rnase-free</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>4716728001</td><td>フローサイトメトリー, -20°C;</td></tr><tr><td>カルシウム、マグネシウム、グルコース、ピルバット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ</td>州、米国<td>14287080</td>バッファーを含むC D-PBS<td>、4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>D-PBS、カルシウムなし、マグネシウムなし</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>14190250</td><td>バッファー、4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>65-0865-14</td><td>フローサイトメトリー、4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3/転写因子染色バッファーセット</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>00-5523-00</td><td>フローサイトメトリー、4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>Falcon (15 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>11507411</td><td>Cell</td></tr><tr><td>tube Falcon (50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>10788561</td><td>Cell tube&nbsp;</td></tr><tr><td>ファルコン&nbsp;丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナースナップキャップ付き、5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>08-771-23</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>FcR ブロッキング試薬、マウス&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、NRW、ドイツ</td><td>130-092-575</td><td>MACS of oligodendrocytes, store at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>雌 C57BL/6J マウス</td><td>Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany</td><td></td><td>アクティブ EAE 誘導&nbsp;</td></tr><tr><td>子牛胎児血清(FCS)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>F2442-50ML</td><td>フローサイトメトリー, -5 to -20 >C</td></tr><tr><td>FITC ラット アンチ CD 11b&nbsp;(クローンM1/70)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>553310</td><td>フローサイトメトリー, 4°C;C</td></tr><tr><td>フロイント'完全なアジュバント</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>AR001</td><td>アクティブEAEインダクション, 4 >C</td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-093-237</td><td>CNS組織解離</td></tr><tr><td>GentleMACS Octo Dissociator with</td><td>Heaters Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-096-427</td><td>CNS組織解離</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 8.4.3</td><td>Graphpad by Dotmatics</td><td></td><td>Graphical Analysis</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie, North Chicago,イリノイ州、米国</td><td></td><td>アクティブEAE誘導、4°で保存。C</td></tr><tr><td>Kaluza Analysis Software V2.1.1</td><td>Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA</td><td></td><td>フローサイトメトリー解析</td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-042-401</td><td>MACS</td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-091-376</td><td>PB-buffer</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW,ドイツ</td><td>130-042-303</td><td>MACS&nbsp;</td></tr><tr><td>MOG<サブ>35&ndash;55 peptide</td><td>Charit&eacute;, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egr&egrave;ve, France)</td><td></td><td>アクティブEAE誘導、-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>結核菌株 H37 Ra</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA</td><td></td><td>アクティブEAE誘導、4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>ニューロン分離キット、マウス&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、NRW、ドイツ</td><td>130-115-390</td><td>ニューロンのMACS、4°で保存。C</td></tr><tr><td>O4抗体、抗ヒト/マウス/ラット、APC、(クローンREA-576)</td><td>Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、NRW、ドイツ</td><td>130-119-897</td><td>フローサイトメトリー、4°Cで保存。</td></tr><tr><td>C グリセロール中の百日咳毒素</td><td>Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA</td><td>BT-0105</td><td>Active EAE induction; save at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>pluriStrainer Mini 100 &mu;m&nbsp;</td><td>pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany</td><td>43-10100-40</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td><td>130-090-976</td><td>MACS</td></tr><tr><td>Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763)</td><td>Abcam, Cambridge, UK</td><td>EPR12763</td><td>フローサイトメトリー, -20 °Cで保存;C</td></tr><tr><td>Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm</td><td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td><td>15067</td><td>CNS tissue dissection</td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>15250061</td><td>細胞数え方&nbsp;</td></tr><tr><td>ウルトラピュア 0.5&nbsp;M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>15575020</td><td>フローサイトメトリー, 室温で保存</td></tr></tbody></table>

成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

Simultaneous Isolation of Principal Central Nervous System-Resident Cell Types from Adult Autoimmune Encephalomyelitis Mice

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の最も一般的なマウスモデルであり、新しい治療戦略を開発するために、MSのまだ知られていない病因をさらに解明するために頻繁に使用されます。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(MOG35-55)EAEモデルは、免疫後10日以内に上行麻痺を伴う自己制限的な単相性疾患経過を再現します。マウスは、臨床スコアリングシステムを使用して毎日検査されます。多発性硬化症は、特定の時間的パターンを持つさまざまな病態メカニズムによって引き起こされるため、疾患の進行における中枢神経系(CNS)常在細胞型の役割の調査は非常に興味深いものです。このプロトコルの独特な特徴は大人のEAEおよび健康なマウスで適当なすべての主要なCNS常駐のセルタイプ(ミクログリア、オリゴデンドロサイト、astrocytesおよびニューロン)の同時隔離である。成体マウスの脳と脊髄の解離に続いて、磁気活性化細胞選別(MACS)を行い、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロンを単離します。フローサイトメトリーを使用して、精製した単一細胞懸濁液の品質解析を行い、細胞単離後の生存率を確認し、各細胞タイプの純度が約90%であることを示しました。結論として、このプロトコルは、健康なマウスとEAEマウスの複雑な細胞ネットワークを分析するための正確で包括的な方法を提供します。さらに、4種類の細胞すべてが同じマウスから単離されるため、必要なマウス数を大幅に減らすことができます。

現在のプロトコルは、すべての主要なCNS常在細胞、すなわち、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびニューロンを1つのCNS複製から同時に分離する可能性を提供します。これは、この種の実験に必要なマウスの数を減らし、細胞レベルでの分子および生化学的分析の比較可能性を確保するために重要です。個々の細胞タイプが異なるCNS複製から単離されている場合、細胞間相互作用を真実にマッピングすることができず、単離プロセス中の潜在的な技術的逸脱により、さらに下流の解析にバイアスがかかる可能性があります。さらに、各細胞タイプからの分子的および生化学的所見は、同じEAEコンテキストに由来しないため、互いに比較できません。市販のシステム/キットを使用した既存のMACSプロトコルは、上記の細胞タイプの同時単離を可能にするように適合されました。
ミクログリアの単離は抗CD11bマイクロビーズを用いて行い、オリゴデンドロサイトは抗O4マイクロビーズ(表1)を介して単離し、抗ACSA-2マイクロビーズはアストロサイト(表2)の単離に用いた。対照的に、ニューロンの単離は負の選択を表し、すべての非ニューロン細胞のビオチン化と磁気標識によって達成されました(表2)。血液細胞を除くすべての非神経細胞(例えば、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、アストロサイト、内皮細胞、および線維芽細胞)は、これらの非ニューロン細胞に発現する表面抗原に対して特異的に向けられたビオチン標識抗体を使用して磁気標識することができる(表2)。これらの磁気的に標識された非神経細胞を枯渇させることにより、高純度で生存可能な神経細胞集団を生成することができる30,42,43。
生成されたシングルセル懸濁液の純度分析用に、2つの新しいフローサイトメトリーパネルを設計しました。ここでは、生細胞/死細胞の識別と組み合わせた細胞タイプ特異的な表面マーカーと核マーカーを使用しました。
得られたマウスおよび細胞タイプごとの細胞収量(図3A)を分析したところ、平均8個が得られました。4 x 105 ± 3 x 104 ミクログリア、3.23 x 106 ± 1 x 105 オリゴデンドロサイト、8.6 x 105 ± 2 x 104 アストロサイト、4.5 x 105 ± 1 x 10 ナイーブマウスあたり4 ニューロン。
神経炎症の疾患モデルを調査する目的で、プロトコルはEAEのマウスモデルにも適用されました。マウスは、EAE誘導後16日目に安楽死させ、疾患の最大値を表した。このEAE設定では、約2.9×106 ±6.7×105 個のオリゴデンドロサイト、5.2×105 ±9×104 個のアストロサイト、4.4×105 ±4×104 個のニューロンが単離された。ミクログリア細胞の収量は、MACSステップの後に追加の細胞ソーティングを行ったため、EAEマウスあたり約1.7 x 105 ± 4 x 104 ミクログリアに減少しました(図3A)。
単離後、フローサイトメトリーによるさまざまな細胞集団の表現型特性評価により、すべての主要なCNS常在細胞タイプについて純度約90%の生存可能な単一細胞懸濁液が達成できることが証明されました(図3B)。ミクログリアは、文献44,45,46,47で定義されているように、CD45intCD11bが高いものとしてゲーティングされた。
EAEでは、ミクログリアをすべてのCD11b+細胞から選別して、神経炎症中に中枢神経系に移行する単球、好中球、ナチュラルキラー細胞、顆粒球、マクロファージなどの他のCD11b+免疫細胞と区別する必要がありました27,28,48。したがって、ミクログリアは、CD11b+細胞懸濁液からCD45intCD11高細胞として選別されました。ミクログリアの選別戦略全体を図4に示します。ナイーブマウスでは、ミクログリア集団は全生単一細胞の91.16%(CD11b+全個体群の96%)であった(図4A)。EAEマウスでは、ミクログリア集団は全生単一細胞の46.85%(CD11b+全集団の55%)であった(図4B)。MACS法とFACS法はどちらも単一細胞に機械的ストレスを加えますが、選別された精製ミクログリアの75.41%±8.63%が生存可能でした(図3B)。
最初のCNS細胞懸濁液から直接単離されたアストロサイトとニューロンは、オリゴデンドロサイトとの関連する汚染を示し、オリゴデンドロサイトの負のフロースルーからニューロンとアストロサイトを同時に分離することで、この汚染を防ぐことができるという仮定につながりました。フローサイトメトリー解析により、オリゴデンドロサイトのネガティブフロースルーから単離されたアストロサイトの純度は89.23%±2.78%であり、生存率は80.56%±1.41%であることが確認されました。これらの結果と同様に、O4- 細胞画分から単離されたニューロンの純度は81.25%±3.31%であり、生存率は83.90%±2.61%でした(図3B)。また、これらの知見は、オリゴデンドロサイトの単離に続いてのみ、これら2種類の細胞を同時に単離しても、生存可能な機能細胞の量に影響を与えないことを裏付けています。
単離された単一細胞懸濁液の生存率および純度に関する結果は、単離マウスで得られたものと比較してEAEマウスで非常に類似しており、このプロトコルがEAEの状況だけでなく健康なマウスにも適していることが確認されました(図3B)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig03.jpg"> 図3:単離されたCNS常在細胞の細胞収量とフローサイトメトリーによるバリデーション。(A) ナイーブマウスおよびEAEマウスにおけるCNS常在細胞の単離後のマウスおよび細胞タイプごとの細胞収量。棒グラフは、提示されたプロトコルの実装後のマウスおよび細胞タイプごとの細胞収量を視覚化します。ナイーブマウスでは5つの生物学的複製を解析し、EAEマウスでは4つの生物学的複製を解析した。それぞれの手段±SEMが描かれています。(B)精製された細胞画分の対応する純度および生存率分析。棒グラフは、得られた単一細胞懸濁液の生存率と純度を、細胞タイプ特異的マーカーの発現に基づいて示しています。NeuNは、ニューロンの細胞型特異的な核マーカーとして使用されました。5つの生物学的複製を取得し、健常マウスとEAEマウスの両方について、各細胞タイプについて比較しました。SEM±それぞれの手段が示されています。略語:抗ACSA-2 =アストロサイト細胞表面抗原-2;CD11b = サイクリン依存性キナーゼ11B;CD45 =受容体型チロシン-プロテインホスファターゼC;CNS = 中枢神経系;EAE = 実験的自己免疫性脳脊髄炎;MACS = 磁気活性化セルソーティング;NeuN =RNA結合蛋白質fox-1相同物3;O4 = オリゴデンドロサイトマーカー O4;SEM = 平均の標準誤差。この数字は49 から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig04.jpg"> 図4:CD11b+細胞単離後のミクログリアの細胞選別のためのゲーティング戦略。(A) ナイーブマウスおよび(B)EAEマウスにおけるゲーティング戦略。各パネルの上段はソート前のドットプロット、下段はソート後のドットプロットです。生細胞(SSC−A/FSC−A)および単一細胞(FCS-H/FSC-W)を選択した後、CD45intCD11b+ 細胞の集団をミクログリア集団として選別した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

これまでのところ、すべての主要な中枢神経系常在細胞タイプを同じマウスから同時に単離するためのプロトコルは、満たされていない需要です。プロトコルはneuroinflammationの間に複雑な細胞ネットワークを調査し、同時に必須のマウス数を減らすために素朴で、実験的な自己免疫の脳脊髄炎のマウスで適当なプロシージャを示す。

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common murine model for multiple sclerosis (MS) and is frequently used to further elucidate ...

多発性硬化症などの自己免疫疾患における分子および細胞メカニズムを調査するために、再現性のある高度な細胞分離プロトコルの生成は満たされていないニーズです。中枢神経系に常在する細胞を単離・解析する現在の技術のほとんどは、1種類の細胞のみに焦点を絞ったり、出生後のマウスのみに焦点を絞ったりするなど、重大な欠点を示しています。1つのCNS複製からすべての主要なCNS常在細胞タイプを同時に単離するための現在のプロトコルは、健康なマウスおよび実験的自己免疫性脳脊髄炎のマウスに適用可能な、1つの単一細胞懸濁液からの複雑なニューロンネットワークおよび新しい炎症経路をex vivoで分析する可能性を提供します。さらに、マウス数が減少する 健康なマウスとEAEマウスにおける4つの主要なCNS常在細胞タイプすべてを同時に分離するための当社のプロトコルは、新しい炎症経路を研究する研究グループにとって有用なツールとして使用でき、複雑な生体分子メカニズムと細胞ネットワークex vivoのより正確な分析を可能にします。私たちのプロトコルの助けを借りて答えることができる新しい科学的質問は、神経炎症、神経変性、寛解などの疾患経過のさまざまな段階でのEAEの動的な調査です。また、細胞間相互作用と生化学的経路は、個人レベルで研究することができます。同様に、機能アッセイは培養細胞で実施できます。EAEの時点で1つの個々のCNSホモジネートからのマルチオミクス解析のためのEAEコースの動的研究に焦点を当てる予定です。

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生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans...

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

この論文では、脳、脊髄、髄膜など、中枢神経系内の常在免疫細胞および末梢由来の免疫細胞を調べるための2つの最適化されたプロトコルを紹介します。これらの各プロトコルは、定常状態および炎症状態下でこれらのコンパートメントを占める細胞の機能と組成を確認するのに役立ちます。...

免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の動物モデルであり、ヒトの疾患と強力な体液性自己免疫応答を共有しています。ここでは、EAE免疫マウスの血清中の自己抗体を定量するためのシンプルで柔軟なELISAプロトコルを報告します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するマウスにおける自己反応性抗体の定量化

視神経切断は、成体中枢神経系の損傷の広く使用されているモデルです。軸索は完全に軸索切断後14日以内に死亡する（軸索切断）transectedされる網膜神経節細胞（RGCs）の90％。このモデルは、実験操作に簡単に従順し、再現性の高いです。...

視神経切断：中枢神経系における成人ニューロンのアポトーシスのモデル

学ぶ 成体自己免疫性脳脊髄炎マウスから主要な中枢神経系常在細胞型を同時単離する方法。ミクログリアやオリゴデンドロサイトなどを一頭のマウスから高純度に分離し、神経炎症における細胞動態と分子メカニズムを正確に解析できます。

成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

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