Name: 自閉症スペクトラム障害の ショウジョ ウバエモデルにおける行動評価のパラダイム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶ Drosophilaを用いた自閉症スペクトラム障害の行動評価法。攻撃性、社会的距離、求愛、グルーミング、習慣化の5つのパラダイムで、遺伝子と行動欠損の関係を定量的に解析する標準的手法を解説します。

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慣れと匂い選択アッセイのセットアップを提供してくれたMani Ramaswami氏(NCBS、バンガロール)とBaskar Bakthavachalu氏(IIT Mandi)、アグレッションアッセイに関する貴重な提案をしてくれたPavan Agrawal氏(MAHE)、求愛アッセイチャンバーのプロトタイプとFmr1変異フライラインを共有してくれたAmitava Majumdar氏(NCCS、プネー)、MB247-GAL4ラインを共有してくれたGaurav Das氏(NCCS、プネー)に大変感謝しています。ショウジョウバエ株については、Bloomington Drosophila Stock Center(BDSC、米国インディアナ州)、国立遺伝学研究所(国立遺伝研、京都)、バナーラスヒンドゥー大学(BHU、バラナシ、インド)、国立生物科学センター(NCBS、バンガロール、インド)に感謝します。研究室での研究は、SERB-DST(ECR/2017/002963)からADへの助成金、ADに授与されたDBT Ramalingaswamiフェローシップ(BT/RLF/Re-entry/2016年11月)、およびインドのIITカラグプルからの機関支援によって支援されました。SDとSMは博士号を受け取りますCSIR-Senior Research Fellowshipからフェローシップ。PMは、インドのMHRDから博士号を取得しました。

ショウジョウバエ 自閉症スペクトラム障害の遺伝的および行動的形質のモデル

著者には、開示すべき利益相反はありません。

ショウジョウバエ は、ハエとヒトの疾患遺伝子との間の遺伝子配列の高度な保存により、ヒトの神経障害の研究のための優れたモデル生物として使用されています9。数多くの堅牢な行動パラダイムにより、ヒトの疾患を再現する突然変異体に現れる表現型を研究するための魅力的なモデルとなっています。自閉症スペクトラム障害(ASD)には何百もの遺伝子が関与しているため、どのモデル生物にも共通のASDモデルは存在しません。したがって、各変異体について、研究者はまずハエのASD様表現型を確立する必要があります。この論文では、そのような評価のために5つのハエ行動パラダイムを協調して使用することを提案することにより、プロセスを合理化することを試みました。これらのパラダイムは、ヒトASD患者の主要かつ一般的に発生する行動障害(社会的およびコミュニケーション障害、反復行動の強化、および慣れ障害)を評価するためにハエで採用されています。ハエの遺伝子変異がこれら5つのパラダイムのすべてまたはほとんどに欠陥を示している場合、それはASDのようなシナリオを強く示している可能性があります。
ここで説明した行動パラダイムのほとんどは、さまざまな研究課題を解決するために以前の文献で複数回使用されてきました。異なる研究間で技術にばらつきが見られることは珍しくありません。手法の微調整は、研究のニーズに一致し、解決される特定の問題の要求に合うように行われました。例えば、求愛アッセイでは、未熟なオス65、処女メス66,67、予め交配されたメス68,69,70、凍結殺された処女メス65、または斬首されたメス19であってもよいテスターフライに向けて、先天的および学習的な求愛行動を定量化することができる.この論文で説明した方法では、野生型の事前交配メスをテスターとして使用して、オスのASDモデルフライの求愛パターンを確認しました。妊娠した女性のsexual受容性は、処女のハエ71のそれよりも比較的低いです。その結果、男性の求愛試合の数とその期間は、処女よりも交尾した女性に向かっています。同様に、交尾までの潜伏期間も処女テスターの女性よりも長く、その場合、早期の交尾は求愛指数の低下につながり、遺伝子型間の効果的な比較の範囲が狭まります。したがって、テスターとしてプレメイトメスを使用すると、ASDフライと野生型フライの求愛行動の比較分析が向上します。一方、処女の雌の使用は、交配された雌が使用されるときに隠される可能性のある追加情報を提供する可能性があります。交尾した女性の使用も、男性の求愛行動に影響を与え、変化させる可能性があります。要するに、研究者は特定の実験の必要性に応じて実験戦略と詳細を選択することが提案されます。
ASD遺伝子の一部またはすべてのハエの相同体にこの技術を適用する前に、ここで注意する必要があります。これらすべての行動パラダイムは、特定の少数のニューロンによって調節されています。特定の遺伝子の発現は、特定の行動パラダイムに進む前に、まず確立されなければなりません。例えば、ASD関連遺伝子のハエ相同体がキノコ体ニューロンまたはグルタミン酸作動性ニューロンで発現していない場合、その変異体では求愛行動およびグルーミング行動は影響を受けない可能性がある。
研究者が注意しなければならないもう一つの点は、欠陥がないからといって、必ずしも突然変異に役割がないわけではないということです。例えば、 Fmr1 変異体を用いたグルーミング行動実験では、グルーミング総試合回数は変異体の方が対照群よりも有意に低くないが、グルーミング指数などの他のパラメータはグルーミング行動に欠陥があることを示している。これは、 Fmr1 変異体における各グルーミング試合の延長によって説明できる可能性があり、その結果、総試合時間がはるかに長いにもかかわらず、総試合数の数が少なくなっています。これは、各行動パターンの複数のパラメーターを定量化する必要性を強調しています。さらに、ASDという用語は、数百の遺伝子のいずれかの変動によって引き起こされる広範な疾患をカバーし、その結果、罹患した個人の間でさまざまな程度の浸透度を持つ不均一な表現型が生じることを覚えておく必要があります。たとえば、慣れ不足は一部の患者で観察されますが、すべての患者で観察されるわけではありません。同じことが、この病気のハエモデルでも予想されます。
攻撃的行動の分析のために、この研究では、突進、翼の脅威、取っ組み合いなど、さまざまなタイプの攻撃的パラメータが考慮されました(図1)30。各試合は、個々の試合タイプまたは合計試合数として識別され、カウントされる必要があります。まず、オスのハエの攻撃性パターン(59,72に記載され、図1に示されている)について理解することが重要です。アグレッシブな試合数を数える際には、1つのアグレッションイベントのスタートポイントとエンドポイントを明確に特定する必要があります。1回の試合で複数のタイプの攻撃パターンが表示され、その後に試合が終了することもあります。攻撃性の試合は、ハエが攻撃的な行動や動きを2秒間示さなくなったり、試合を止めて歩き始めたときに終了したと見なされます。
これらの行動パラダイムのほとんどは、複数の研究所によって説明されている複数のバリエーションと進歩を持っています。それぞれの特定の変更は、特定の目的のニーズを満たすために作成されていました。同様に、自動化されたアルゴリズムベースの定量化または分析技術により、これらの技術は手動エラーの可能性から解放されました。この論文では、最も基本的な手法を最小限の材料要件で実証し、これらの手法を最大数の研究者が簡単に採用して使用できることを願っています。

自閉症スペクトラム障害(ASD)は、神経障害の異質なグループを包含しています。これには、社会的コミュニケーションと社会的相互作用における多文脈的で持続的な欠損、および制限された反復的な行動および活動パターンと関心の存在を特徴とする、さまざまな複雑な神経発達障害が含まれます1。世界保健機関(WHO)によると、世界中で100人に1人の子供がASDと診断されており、男女比は4.22です。この病気は生後2年目または3年目に明らかになります。ASDの子供は、社会的感情的な互恵性、非言語的コミュニケーション、および関係スキルに関心がないことを示しています。彼らは、型にはまった運動、柔軟性に欠ける儀式化されたルーチンのフォロー、制限された興味への集中など、反復的な行動を示します。ASDの子供は、触覚、嗅覚、音、味覚に対して高い反応を示しますが、痛みと温度の反応は比較的低いです1。この障害の浸透度は、ASDに苦しむ患者によっても異なるため、変動性が増加します。
ASDの現在の臨床診断は、ASDのすべての形態をカバーする確認的なバイオマーカーベースまたは一般的な遺伝子検査がないため、個人の行動評価に基づいています3。遺伝的および神経生理学的基盤を解読することは、治療戦略を標的にするのに役立ちます。過去10年間で、大規模な研究により、ASD患者で欠失または変異した、または発現レベルが変化する数百の遺伝子が特定されました。現在進行中の研究では、マウスやショウジョウバエなどのモデル生物を用いて、これらの候補遺伝子の寄与を検証することを強調しており、これらの遺伝子をノックアウトまたはノックダウンした後、ASD様の行動障害の検査を行い、異常を引き起こす根本的な遺伝的および分子的経路を解明しています。ヒト染色体遺伝子座16p11.2でコピー数多型(CNV)を再現したマウスモデルは、ASDの行動上の欠陥4,5,6の一部を示しています。催奇形性薬物バルプロ酸(VPA)への出生前曝露は、ヒトASD7,8に似た形質を示す別のマウスモデルです。さらに、遺伝的症候群に関連する自閉症を示すマウスモデル、例えば、Fmr1、Pten、Mecp2、Cacna1cの突然変異によって引き起こされる単一遺伝子症候群モデル、およびCntnap2、Shank、Neurexin、またはNeuroligin遺伝子5のような遺伝子の突然変異によって引き起こされる単一遺伝子非症候群モデルが存在する。
ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)は、ASDを含む多数のヒト疾患の細胞、分子、および遺伝的基盤を研究するためのもう1つの著名なモデル生物です9。ショウジョウバエとヒトは、分子レベル、細胞レベル、シナプスレベルで高度に保存された生物学的プロセスを共有しています。ショウジョウバエは、ASDに関連する遺伝子を特徴付け、シナプス形成、シナプス機能と可塑性、神経回路の組み立て、および成熟におけるそれらの正確な役割を解読するために、ASD研究10,11,12で成功裏に使用されています。ASD関連遺伝子のハエ相同体は、社会的および/または反復行動の調節に役割を果たしていることがわかった11,13,14,15,16,17,18,19,20,21。ショウジョウバエは、ASD遺伝子とその変異体15,22,23のスクリーニングのモデルとしても機能しています。ハエのASD研究における最大の課題は、他の疾患モデルとは異なり、単一のASDハエモデルがないことです。特定のASD遺伝子の突然変異やノックダウンの影響を理解するためには、研究者は行動表現型がASD患者の症状を十分に模倣しているかどうかを検証し、表現型の分子的または生理学的基盤の理解に進む必要があります。
したがって、ASD様表現型の検出は、ハエモデルでのASD研究に不可欠です。社会的行動/相互作用、コミュニケーション、反復行動、刺激に対する反応性の欠損などの異常を検出することを可能にする、いくつかの行動技術が長年にわたって登場してきました。さらに、これらの行動手法のいくつかの修正とアップグレードは、アップスケーリング、アッセイの自動化、読み出し、定量、比較方法などの特定の要件に合わせて、さまざまなラボで行われています。このビデオ記事では、5つの行動パラダイムの最も基本的なバージョンが示されており、それらを組み合わせることで、ASDのような行動結果を最も簡単な方法で検出できます。
攻撃性は、生存と生殖に影響を与える進化的に保存された生来の行動です24。同種に対する攻撃的な行動は、「社会化の動機」25,26および「コミュニケーション」27の影響を受け、どちらもASDの影響を受けた個人では損なわれます。攻撃的な行動はショウジョウバエによく記載されており、堅牢な攻撃性アッセイ28,29,30およびよく理解された遺伝的および神経生物学的基礎31を通じてその定量化可能性は、ハエモデルにおけるASD表現型を評価するための適切な行動パラダイム32となる。攻撃性は、社会環境から離れた社会的孤立の影響を受け、それが攻撃性の強化につながります。オスのハエが数日間隔離されて飼育されている場合も同じことが観察されています33,34。ハエの社会性を定量化する別の行動アッセイは、ハエの小グループにおける最も近い隣人とハエ間の距離を測定するソーシャルスペースアッセイ35であり、ハエ12,21,36,37および環境的に誘発されたASDハエモデル38におけるASD遺伝子オルソログの役割をテストするのに最適である。39.
 ショウジョウバエの求愛アッセイは、自閉症関連遺伝子18,19,21,40を含む、回路または遺伝子操作による社会的およびコミュニケーションスキルの変化をアッセイするために頻繁に使用される別の行動パラダイムです。ASD患者には反復的な行動パターンが一般的であり、ハエではグルーミング行動(清掃やその他の目的で行われる一連の明確なステレオタイプな行動)によって再現されます。これは、ハエ21,41のASD遺伝子変異の影響、および化学物質38,39への曝露の影響をアッセイするために成功裏に使用されています。アッセイの複数の進歩と自動化は、16,41,42,43以前に説明されています。ここでは、最も基本的なアッセイパターンを示しており、これは採用と定量が容易です。
ASDは、一部の患者44,45,46,47,48,49,50、ASDモデル生物51,52の慣れ、学習、および記憶の能力に影響を与えることが知られており、また、さまざまな嗅覚行動50の欠損を引き起こします。ショウジョウバエのライトオフジャンプ慣れは、ASD遺伝子のスクリーニングに以前に使用されてきました23。馴化は、嗅覚馴化アッセイ53,54,55の簡単な方法によってアッセイすることができる。我々は、嗅覚の慣れを誘導する方法を説明し、ASD遺伝子変異体または遺伝子ノックダウン状態における馴化の欠陥を検出するために使用できる古典的なY迷路ベースのバイナリ匂い選択アッセイ56を使用して結果をアッセイする。突然変異(または遺伝子ノックダウン)または薬理学的治療がハエの行動に及ぼす影響がASD様表現型に相当するかどうかを評価するために、ここで説明するこれらの5つのアッセイを組み合わせて使用できます。

<table><tbody><tr><td>アグレッションアリーナ:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明なポリスチレン</td><td></td><td></td>製の標準的な24ウェルプレート <td>12 cm x 8 cm x 2 cm. 1つのウェルの直径= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; 深さ= 1 cm</td></tr><tr><td>透明なプラスチック/アクリルシート</td><td></td><td></td><td>代替:細胞培養プレートの穴あき蓋</td></tr><tr><td>Social Space Assay:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バインダークリップ</td><td></td><td></td><td>19 mm</td></tr><tr><td>カスタマイズされたサイズの</td><td></td><td></td>ガラスシートとアクリルシート<td>厚さ= 5 mm</td></tr><tr><td>求愛アッセイ:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナットとボルト、カスタマイズされた</td>形状<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>のねじ切りパースペックスシートi)蓋:カスタムメイドの丸い透明なパースペックスディスク(厚さ2〜3 mm、直径70 mm)で、周辺領域に1つのローディング穴と中央に別のネジ穴(それぞれ直径~3 mm)があります。ii)中心から等距離にある直径15mmの6〜8個のミシン目を持つ、2番目の透明で厚いパースペックスディスク(厚さ3〜4mm、直径70mm)。iii)ベース:ローディングホールなしを除いて蓋と同じです</td></tr><tr><td>グルーミングアッセイ:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>拡散ガラスで覆われたLEDパネル</td><td></td><td></td><td>10&ndash;15ワットの天井に取り付け可能なLEDパネル</td></tr><tr><td>HabituationおよびY迷路アッセイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クライミングチャンバーx2</td><td></td><td></td>、Y迷路をエントリーバイアル<td></td></tr><tr><td></td><td></td>Perspex<td>に接続するための</td>ホウケイ酸ガラスアダプター<td>、カスタムメイド、Figure 5A</strong</td></tr><tr><td>>Clear試薬ボトルBorosil</td><td></td><td></td><td>#1500017</td>での測定</tr><tr><td>ガス洗浄ストッパー</td><td></td><td></td><td>ボロシル #1761021</td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td></td><td></td><td>OD= 25 mm x 高さ= 85 mm;ホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>臭気物質(酪酸エチル)</td><td></td><td></td><td>メルク #E15701</td></tr><tr><td>パラフィンワックス(液体)ライト</td><td></td><td></td><td>SRL #18211</td></tr><tr><td>ローラークランプ</td><td></td><td></td><td>Polymed #14098</td></tr><tr><td>シリコーンチューブ</td><td></td><td></td><td>OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; 流量制御用ローラークランプ</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td></td><td></td><td>花 #HN-648 (流れ方向の任意の水槽ポンプ手動で反転)</td></tr><tr><td>Y迷路</td><td></td><td></td><td>ホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>Y字型ガラス管(ホウケイ酸ガラス)</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド、Figure 5A</td></tr><tr><td>での測定一般的なアイテム:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビデオ再生用の任意のソフトウェア(VLCメディアプレーヤーなど)</td><td></td><td></td><td>https://www.videolan.org/vlc/</td></tr><tr><td>ビデオデータ分析</td><td></td><td></td><td></td>用コンピュータ</tr><tr><td>フライボトル</td><td></td><td></td><td>OD= 60 mm x 高さ= 140 mm; ガラス/ポリプロピレン</td></tr><tr><td>フライバイアル</td><td></td><td></td><td>OD= 25 mm x 高さ= 85 mm;ホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>グラフパッド プリズムソフト</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>ImageJ ソフト</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://imagej.net/downloads タイマー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビデオカメラ ビデオ録画機能</td><td></td><td></td>付き <td>ビデオカメラ ビデオカメラ または携帯電話のカメラが動作します</td></tr><tr><td>フライアスピレーター用:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>綿</td><td></td><td></td><td>吸収剤、オートクレーブパラ</td></tr><tr><td>フィルム</td><td></td><td></td><td>シグマアルドリッチ #P7793</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td></td><td></td><td>200&micro;Lまたは1000&micro;L、シリコンチューブの外径にdepedingを選択します</td></tr><tr><td>シリコン/ゴムチューブ</td><td></td><td></td><td>の長さ= 30-50 cm。チューブは無臭</td></tr><tr><td><強くなければなりません>フライフードの組成:</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成分(食品1Lの量)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>寒天(8 g)</td><td></td><td></td><td>SRL #19661(CAS:9002-18-0)</td></tr><tr><td>コーンスターチ(80 g)</td><td></td><td></td><td>有機、地元調達D</td></tr><tr><td>-グルコース(20 g)</td><td></td><td></td><td>SRL#51758(CAS:50-99-7)</td></tr><tr><td>プロピオン酸 (4 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)</td></tr><tr><td>ショ糖 (40 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)</td></tr><tr><td>Tego (メチルパラヒドロキシ安息香酸) (1.25 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)</td></tr><tr><td>酵母粉末 (10 g)</td><td></td><td></td><td>HIMEDIA # RM027</td></tr><tr><td>この研究の実験で使用したフライライン:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>野生型(カントンSまたはCS)</td><td></td><td></td><td>BDSC #64349</td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td></td><td>BDSC #3605</td></tr><tr><td>w [1118];Fmr1[&デルタ;50M]/TM6B, Tb[+]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 6930</td></tr><tr><td>w[*];Fmr1[&デルタ;113M]/TM6B, Tb[1]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 67403</td></tr><tr><td>MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 50742</td></tr><tr><td>LN1-GAL4</td><td></td><td></td><td>NP1227, NPコンソーシアム, Japan</td></tr><tr><td>row-shRNA</td><td></td><td></td><td>BDSC # 25971</td></tr></tbody></table>

自閉症スペクトラム障害の ショウジョ ウバエモデルにおける行動評価のパラダイム

Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的相互作用やコミュニケーション能力の欠損、制限された行動や反復的な行動の強化、場合によっては学習障害や運動障害などの一般的な行動症状を伴う神経発達障害の異質なグループを包含しています。 ショウジョウバエ は、多くのヒトの疾患をモデル化するための比類のないモデル生物としての役割を果たしてきました。ASDには多くの遺伝子が関与しているため、ショウジョウバエは、障害に関与していると推定される遺伝子をテストする強力で効率的な方法として浮上しています。ASDには、さまざまな機能的役割を持つ何百もの遺伝子が関与しているため、ASDの単一の遺伝的ハエモデルは実現不可能です。代わりに、個々の遺伝子変異体、遺伝子ノックダウン、またはASD関連遺伝子のハエホモログの過剰発現ベースの研究が、これらの遺伝子産物の根底にある分子経路に関する洞察を得るための一般的な手段です。 ショウジョウバエ では、特定の行動要素の欠損を簡単に読み取ることができる多くの行動手法が利用可能です。ソーシャルスペースアッセイ、およびハエの攻撃性および求愛アッセイは、社会的相互作用またはコミュニケーションの欠陥を評価するのに有用であることが示されています。ハエのグルーミング行動は、反復行動の優れた読み出しです。ハエのアハエでは、一部のASD患者で影響を受けることがわかっているアハエの学習能力を推定するために使用されます。これらの行動パラダイムの組み合わせを利用して、ハエのヒトASD様疾患状態を徹底的に評価することができます。 Fmr1 変異型ハエ、ヒトにおけるFragile-X症候群の再現、およびハエニューロンにおけるPOGZ-ホモログ 行 ノックダウンを用いて、社会的間隔、攻撃性、求愛行動、グルーミング行動、および慣れにおける定量化可能な欠損を示しました。これらの行動パラダイムは、ハエモデルにおけるASDやその他の神経発達障害の研究に広く使用されることを前提として、ここでは最も単純でわかりやすい形で示されています。

アグレッションアッセイ ハエASDモデルとして、Fmr1変異型ハエが用いられている63,64。w1118匹の雄を対照として用い、Fmr1トランスヘテロ接合体Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57匹の雄を実験用ハエとして使用した。成人男性は、隔離チューブに5日間収容されました。同型男性(同じ遺伝子型、同じ住居条件)が攻撃性アリーナに導入され、彼らの行動が20分間記録されました。20分間の攻撃的な発作の総数を遺伝子型ごとにカウントしました。20分間の攻撃的な発作の数は、変異した雄の場合、対照雄よりも有意に減少することがわかりました(図1E)。Fmr1のハエにおけるこの攻撃性の低下は、他のハエとの社会的相互作用への関心の低下によるものかもしれない。対照的に、グループ/社会的に飼育されたFmr1変異体のオスのハエは、社会的に飼育されたw1118のハエと同等の攻撃性数を示し(データは示さず)、おそらく社会的行動の誘導における社会環境の積極的な役割を示しています。
ソーシャルスペースアッセイ ソーシャルスペースアッセイは 、w1118 およびASDモデル(Fmr1Δ113M / Fmr1Δ50M) のハエで行いました。最も近い隣人までの距離は、各ハエについて計算され、各遺伝子型に対して10回の生物学的複製が行われました。突然変異型のハエは、対照のハエよりも有意に高い近傍距離を示し(図2D)、他のハエからの距離を長くすることを好むことを示しています。
求愛アッセイ シングルハウスのオスのハエの求愛アッセイは、2つの別々のASDモデルハエの生来の求愛行動を定量化するために行われました。まず、Fmr1トランスヘテロ接合ハエの求愛行動をw1118のそれと比較しました。Fmr1ハエは、交尾の試みが減少しただけでなく、求愛指数が有意に低いことを示しました(図3E1)。第2の実験では、ヒトPOGZ遺伝子(ASDリスク遺伝子20が広く分布している)のショウジョウバエオルソログであるrowを、MB247-GAL4ドライバーラインを用いてキノコ体ニューロンの列に対してショートヘアピンマイクロRNAを発現させることによりノックダウンした。これらのローノックダウンASDモデルフライは、生来の求愛パターンに欠陥がないかテストされました。求愛指数と交尾未遂数は、15分間のビデオから計算されました。列ノックダウンハエは、求愛指数と交尾の試みの数が大幅に減少したことを示し(図3E2)、女性に対するコミュニケーションに欠陥があることを示しました。
グルーミング行動 グルーミング行動は、ショウジョウバエ16,42,43の反復行動の読み出しとして使用されます。グルーミング行動は、Fmr1トランスヘテロ接合体ハエで定量化され、w1118のそれと比較されました。Fmr1ハエでは最初のグルーミングまでの潜伏時間が有意に減少しているのに対し、Fmr1フライでは平均グルーミング時間およびグルーミング指数が有意に増加しており(図4C)、ASDモデルハエのグルーミング(または反復)行動が進んでいることを示しています。対照的に、突然変異型ハエのグルーミング発作の総数は、対照のハエのそれと比較して有意に変化していないことがわかった。
嗅覚馴染アッセイ 慣れは、自閉症の個人の多数の欠陥があることがわかっており、 それはショウジョウバエ23で同じためのアッセイとして使用することができます。ここでは、LN1-GAL4によって駆動される嗅局所介在ニューロンの 列 をノックダウンすることにより、ASDモデルで嗅覚の慣れをテストしました。これらの実験では、嫌悪臭物質である20%酪酸エチルが、これらのハエの慣れを誘発するために使用されています。結果は、 ローノックダウンハエが3日間の匂い物質曝露後に慣れなかったことを示しています( 図5E のグラフの最後の2つのバーは、ナイーブハエと慣れハエの間に有意差を示していません)野生型と比較して、酪酸エチルに3日間曝露した後に典型的な慣れを示すハエ(曝露されたハエはナイーブハエと比較してパフォーマンス指数の有意な低下を示します)。これは、 ローノックダウンハエが酪酸エチルに3日間さらされた後、慣れず、反発臭剤によって反発されることを示しており、これらのASDフライが慣れ不足であることを証明しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig01.jpg"> 図1:アグレッションアリーナと代表的な行動パターン (A)フライエントリー用の穴あき蓋を備えた24ウェルプレートのアグレッションアリーナのセットアップ。挿入図: フライフードが入った 1 つのアリーナの寸法。(B)単一の孤立したオスのハエを含む単一ハウジングチューブと、オスとメスのハエを含むグループハウジングバイアルの写真は、社会環境を再現しています。(C)ハエの口内吸引ベースの移植用の吸引器。フライエントリー用のチューブの側面(フライエンド)と口に挿入される側面(口エンド)(C1)を示すフライアスピレーターと、組み立てられたフライアスピレーター(C2)を組み立てるために必要なアイテム。(D)代表的な男性-男性の攻撃的な行動パターン:アプローチ、ウィングスレット、フェンシング、ホールディング、突進、ボクシング、および取っ組み合い。 (E)Fmr1 変異体の雄のハエは、対照と比較して他の雄に対する攻撃的な行動が減少している。 w1118 (対照)と Fmr1 トランスヘテロ接合ハエ(Fmr1Δ113M / Fmr1Δ50M)の社会的に孤立したオスの攻撃的な発作の数を示す箱ひげ図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig02.jpg"> 図2:ソーシャルスペースアッセイアリーナのセットアップ(A)ガラス板とアクリルスペーサーの寸法と配置を示す図。(B)アクリルスペーサーがガラス片の間に挟まれ、下部にフライエントリー用の小さな隙間が残されているアリーナコンポーネントの最終的な配置。ガラス片とスペーサーの間に作られた三角形の空間は、ハエのSSAアリーナであり、ここではハエは2次元でしか動くことができません。(C)チャンバー内にハエがいる最終的なSSAアリーナのセットアップの写真。略語: SSA = ソーシャル スペース配列。(D)ASDモデル(Fmr1トランスヘテロ接合性)のハエは、w1118と比較して、ソーシャルスペースアッセイにおいて互いに距離が増加していることを示している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig03v2.jpg"> 図3:求愛アリーナと代表的な行動パターン。 (A)求愛アッセイアリーナにおけるディスクの設計と(B)配置を示す図。(C)最終手配後の求愛アリーナの写真。(D)交尾した女性に対する素朴な男性の求愛行動パターンを示す代表的な画像:追いかける、向きを変える、翼のちらつき、舐める、交尾の試み、および交尾。(E)2つのASDモデルにおける求愛指数と交尾の試み数を示すプロット:(E1)w1118対照と比較して、求愛指数と交尾の試みの有意な減少を示すFmr1変異体ハエ。(E2)row knockdown flysは、row-shRNAがmushroom bodyニューロン(MB247-GAL4)で発現する別のASDモデルとして使用されました。列ノックダウン時に求愛行動の大幅な減少が観察されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig04.jpg"> (A)円盤または車輪型のアリーナ(図3に示されているのと同じ求愛アリーナ)は、下から均一に照らし出すためのディフューザーを備えたLEDパネルに設置され、ビデオは上からキャプチャされました。これにより、グルーミング中の付属肢の微細な動きを識別するために必要なコントラストが向上します。(B)成体のオスのハエで観察されたグルーミング行動パターンの写真。T1 =1 番目の脚のペア、T2 = 2番目の脚のペア、T3 = 3 番目の脚のペア。直感的な省略された命名法は、Bのグルーミングパターンに使用されます:T1-head =最初の足でこすった頭。T1-T1 = 最初の脚のペアをこすり合わせた、など。略語:LED =発光ダイオード。(C)Fmr1トランスヘテロ接合型ハエで実施されたグルーミングアッセイの結果を示し、w1118と比較したグラフ。Fmr1変異体ハエは、最初のグルーミング試合で有意に遅延が短縮され、対照群と比較してグルーミングが早期に開始されたことを示している。さらに、平均グルーミング試合時間とグルーミング指数はFmr1変異体で有意に増加し、ASDモデルハエの反復行動が強化されたことを示しています。対照的に、グルーミング発作の総数は、対照群と比較して突然変異したハエでは有意に変化しませんでした。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig05.jpg"> 図5:嗅覚馴染化とアッセイ後の代表的な結果のための誘導およびアッセイセットアップ (A)バイナリー臭気選択アッセイセットアップの構成要素:(A1)Y迷路、(A2)アダプター、(A3)これら2つの配置、(A4)Y迷路アームの上部に取り付けるための一対のコレクションチューブ、(A5)Y迷路に進む前に空気が泡立つ臭気溶液または水を保持するためのガラス瓶とガラス管。(B)嗅覚慣れの誘導のためのフライフードボトルのセットアップ。漫画の図(B1)は、臭気物質を含むマイクロフュージチューブがボトル内の中央に銅線から吊り下げられている様子を示しています。(B2)最後に、ボトルの開口部を綿で覆い、茶色の紙の封筒で密封します。(C)Y迷路のセットアップ全体の配置の写真。(D)実験終了後の収集室内のハエの分布を示す写真。(D1)ナイーブなハエ(無臭のパラフィンのみに曝露、制御)は嫌悪臭物質(この研究では慣れの誘導に使用される20%エチル酪酸)に対して反発を示し、通常の空気で満たされたY迷路のアームを選択しますが、(D2)露出した(慣れた)ハエは両方のアームに均等に分布します。略語:ID =内径。(E) 列ノックダウンハエの嗅覚順化アッセイの結果は、順応欠陥を示した。野生型(カントンS)のハエは、酪酸エチルに3日間さらされた後、ナイーブなハエと比較してパフォーマンス指数の大幅な低下を示し、慣れを示しています。 LN1-GAL4 x row-shRNAフライの子孫を3日間ばく露した場合、パフォーマンス指数はナイーブフライのそれと有意に異なることは認められませんでした。これは、これらの列ノックダウンハエが匂い物質に3日間さらされても慣れなかったことを示しており、ヒトのASD様症状を再現しています。略語:ASD =自閉症スペクトラム障害;shRNA = ショートヘアピンRNA。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的およびコミュニケーション的行動の障害と反復行動の出現に関連しています。 ショウジョウバエ モデルにおけるASD遺伝子と行動障害との相互関係を研究するために、この論文では、社会的間隔、攻撃性、求愛、グルーミング、および慣れ行動を分析するための5つの行動パラダイムについて説明します。

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in ...

自閉症スペクトラム障害は子供に影響を及ぼし、コミュニケーション障害、社会的行動、反復行動の増加につながります。ショウジョウバエは、根底にある分子経路を解読するための自閉症研究のモデルとしてますます人気が高まっています。ハエ自閉症モデルの行動特性評価のための一連の標準手法について説明します。ハエの自閉症スペクトラム障害の分子基盤を解読するためには、その行動症状を正確に確立する必要があります。ショウジョウバエの自閉症の人間の行動特性を定量化することは、非常に困難な作業です。ハエには、この障害のすべての行動異常に対処する単一の行動パラダイムはありません。ショウジョウバエで確立された5つの行動パラダイム、すなわち、攻撃性アッセイ、ソーシャルスペースアッセイ、コート形状、グルーミング、および慣れアッセイについて説明しました。これらはすべて、ASDフライモデルで使用して、コミュニケーション行動、反復行動、および社会的行動の障害のレベルを特徴付け、定量化できます。これらの5つの手法を最も単純な形で説明することで、最小限のハエ研究施設を持つすべての研究室がそれらを容易に採用し、自閉症スペクトラム障害のハエモデルで実験を行い、この疾患の理解の進展に貢献できるようにしました。

paradigms-for-behavioral-assessment-drosophila-model-autism-spectrum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、ストレスを受けた個人の回避を定量化するためのプロトコルを提示します。このパラダイムは強力でありながらユーザーフレンドリーであり、Drosophila...

社会回避での定量化のための簡単​​なアッセイキイロショウジョウバエ

高次の制限された反復行動(RRB)は、影響を受けた人々の生活を混乱させます。 これらの行動はげっ歯類でモデル化するのが難しく、RRBの潜在的な治療法や介入に関する基本的な生物医学的研究を困難にしています。...

マウスにおける高次反復行動のための電位アッセイとして新規物体探査

げっ歯類モデルは、自閉症スペクトラム障害(ASD)に関連する主要な行動を研究するための貴重なツールです。この記事では、マウスのASDの主要な特徴をモデル化するための2つの行動テスト、つまり反復行動を評価するセルフグルーミングと、社会的障害を文書化する3チャンバーの社会的相互作用テストについて詳しく説明します。...

マウスの自閉症様行動を評価するための戦略

このプロトコルで説明する手順では、テストステロン投与とテストステロンに関する民間信仰が直接ではなく社会的行動と関連しているかもしれないことを示しています。...

行動内分泌学と実験経済学を組み合わせること：テストステロンと社会的意思決定

トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル

手先の器用さは、主に霊長類の特権であるため、行動タスクはマカクザルで開発されている。...

ヒト以外の霊長類における手先の器用さの行動評価

食品または薬剤ペア合図の応答は、禁欲期間の経過とともに増加し、これが再発の行動への感受性の増加に関連する可能性があります。ここでは詳細自己管理スクロースを持つラットではこの"渇望のインキュベーションを"評価するための手順を。...

ラットのショ糖の渇望のインキュベーションを評価するための一般的な方法

哺乳類における自主的なホイールランニング活動の概日リズムはしっかりと脳内のマスタ·クロックの分子振動に結合されている。このように、この動作の生活リズムは、この体内時計の機能に関する遺伝的、薬理学的、および環境要因の影響を研究するために使用することができます。...

げっ歯類におけるランニングホイール活動の概日リズムの記録および分析

このプロトコルは、ショウジョウバエや他の昆虫を個別に識別するためのシンプルで費用対効果の高い方法を説明しています。ショウジョウバエの3種にわたる交配成功を調査した実証データは、この方法がCO2麻酔の使用と同等またはそれ以上であることを示しています。...

行動アッセイの染色昆虫：麻酔の配偶行動<em&gt;ショウジョウバエ</em

機械感覚に影響を与える新たな突然変異を特定するために、MARCM法によって生成された突然変異クローンのハエの剛毛の触覚刺激に対する行動反応を測定するアッセイを設計しました。これらの技術の組み合わせにより、他の方法では致命的となる機械感受性変異の同定が可能になります。...

でMARCMベースのクローンのMechanosensationための行動アッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

学ぶ Drosophilaを用いた自閉症スペクトラム障害の行動評価法。攻撃性、社会的距離、求愛、グルーミング、習慣化の5つのパラダイムで、遺伝子と行動欠損の関係を定量的に解析する標準的手法を解説します。

自閉症スペクトラム障害のショウジョウバエモデルにおける行動評価のパラダイム

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自閉症スペクトラム障害の ショウジョ ウバエモデルにおける行動評価のパラダイム

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