Name: マウス脾臓組織形成研究のための基底膜マトリックスカプセル化細胞凝集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学ぶ マウス脾臓細胞の基底膜マトリックスカプセル化凝集法。三次元培養と生体内移植を可能にし、組織再生に必要な細胞型の同定や組織工学研究のプラットフォームとして活用できます。

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この研究は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(#GNT1078247)の支援を受けて行われました。

すべての動物実験は、クイーンズランド大学動物倫理委員会(UQBR/079/19)によって承認された実験プロトコルに従って実施されました。
1. 組織採取と間質細胞の調製
<ol><li>0.5〜1.5日齢の雄および/または雌のBALB / c新生児ドナーマウスを、ティッシュペーパーの中に動物を包み、砕いた氷の下に>10分間置くことにより、低体温を誘発して安楽死させます。 注:このプロトコルは、さまざまなマウス株、年齢、および動物の数に適合させることができます。</li>
	<li>滅菌手術器具を準備します。</li>
	<li>マウスを右横置きにします。80%エタノールで皮膚を綿棒で拭き取り、虹彩手術用ハサミで1cm切開して腹壁を露出させます。</li>
	<li>脾臓の上に2回目の0.5cm切開を行い、一対の細かい鉗子を使用して組織を静かに持ち上げます。手術用ハサミを使用して血管を切断し、組織を切除します。氷冷したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むペトリ皿に組織を移します。脾臓に付着している残りの結合組織をすべて取り除きます。 注意: 実体顕微鏡は、手術器具の操作に必要な微細な運動を補助することができます。</li>
	<li>組織全体を解離させるには、新生児脾臓(10個以下のプール)を逆さにした14 mLの円錐形チューブキャップの内側の縁に移します。1 mLシリンジプランジャーのプラスチック製後端を使用して、押し付け動作で組織を機械的に破壊します。</li>
	<li>10 mLのコールドPBSを含む14 mLのコニカルチューブにキャップをしっかりと置き、固定します。チューブを5回ひっくり返して、キャップからチューブに破壊されたすべての組織を洗い流します。</li>
	<li>残りの組織について、手順1.6を繰り返します。</li>
	<li>チューブを氷上に1分間置いて、組織をチューブの底に沈殿させます。</li>
	<li>上清(造血細胞を含む)をリバーシブルの70μmセルストレーナーに通して慎重に廃棄します。</li>
	<li>1 mg/mLのコラゲナーゼIV、40 μg/mLのDNase I、および2%ウシ胎児血清(FBS)を含む新たに調製した2 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(sDMEM)を新たに調製して、間質組織を14 mLのコニカルチューブに洗浄することにより、非可溶性間質画分を回収します。 注意:コラゲナーゼIVおよびコラゲナーゼDは有害物質であり、適切な個人用保護具を使用してバイオセーフティキャビネット内で取り扱う必要があります。</li>
	<li>単一細胞懸濁液を調製するには、プールされた組織(最大20個)を37°Cで10分間、一定回転で酵素消化します。</li>
	<li>1 mg/mLのコラゲナーゼD、40 μg/mLのDNase I、および2% FBSを含む4 mLの新しく調製したsDMEMを間質組織を含むチューブに直接添加します。37°Cでさらに10分間、一定の回転でインキュベートします。</li>
	<li>氷冷したPBSを8 mL添加して消化を停止します。4°Cで200 x g で5分間遠心分離して細胞を回収します。</li>
	<li>上清を廃棄し、1 mLの冷たいPBSに再懸濁し、200 x g で4°Cで5分間遠心分離して細胞を2回洗浄します。 細胞を氷上に保管します。 注:細胞をカウントし、希望の濃度に調整することができます。これには、異なる細胞集団に対する最適化が必要な場合があります。このプロトコルを使用して、0.5 x 106- 1 x 106 間質細胞/脾臓は、ドナーマウスの年齢に応じて、通常回収されます。この段階で細胞を染色し、FACSを選別して細胞組成を定義することができます。</li>
</ol>2. 細胞凝集体のマトリックス封入
<ol><li>滅菌済みP200ピペットチップを-20°Cの冷凍庫で予冷します。</li>
	<li>柔軟な実験用フィルム(パラフィルムなど)を1 cm x 2 cmに切断し、80%エタノールに10分間浸漬し、続いてPBSで10分間浸して滅菌します。実験用フィルムは事前に準備し、無菌状態で保存することができます。</li>
	<li>4°Cで5分間、200 x gで遠心分離することにより、0.5 x 10 6-2.5 x 106細胞を調製します。 上清を注意深く吸引し、残りのPBS容量を約20 μL残します。細胞ペレットを氷上に保管します。 注:残りのPBSは、細胞ペレットを乱すことなく穏やかに吸引して、容量を確認できます。</li>
	<li>P20ピペッターを使用して、氷冷した基底膜マトリックス2 μLを、事前に冷却したP200ピペットチップに吸引します。 注:高濃度の基底膜マトリックス(Corning Matrigel Matrix High Concentrationなど)は、強力な凝固プラグの形成に役立ちます。</li>
	<li>ゆっくりとひねってピペットチップを取り出します。滅菌済みのラボ用フィルムのストリップを伸ばし、フィルムに穴を開けないように注意しながら、ピペットチップの端に置きます。チップをフィルムで包み続け、ピペットチップを密封します。密封された先端を慎重に氷の上に直接置き、フィルムを破裂させないように注意します。</li>
	<li>細胞ペレットを残りのPBSに再懸濁し、基底膜マトリックス上に溶液を静かに層状にします。構造物を氷の上に保管します。</li>
	<li>14 mLのコニカルチューブの中に1.2 mLのクラスターチューブを入れて、遠心分離チューブを調製します。</li>
	<li>ピペットチップをネストチューブ内に置き、400 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>14 mL コニカルチューブを垂直方向に配置し、37 °C で 15 分間インキュベートして、基底メンブレンマトリックスがピペットチップ内で固化します。 注:14 mLのコニカルチューブは、下流のアプリケーションで必要になるまで氷上に置くことができます。</li>
</ol>3. 三次元オルガノイド培養
<ol><li>ピペットチップからラボ用フィルムを慎重に剥がします。</li>
	<li>細いステンレス製ワイヤープランジャーをピペットチップの大きな開口部に挿入します。</li>
	<li>10% FBS、1x Glutamax、1x 非必須アミノ酸(NEAA)、10 μM ロック阻害剤、10 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、50 μM β-メルカプトエタノールを添加した 2 mL の sDMEM を含む未処理の 6 ウェル組織培養プレートの 1 つのウェルにチップから放出されるまで、マトリックスプラグを排出します。 注:組織培養容器と対応する培地の容量は、必要に応じて調整できます。 注意: NEAA、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびβ-メルカプトエタノールは有害物質であり、適切な個人用保護具を使用してバイオセーフティキャビネット内で取り扱う必要があります。</li>
	<li>オルガノイドを37°C、5%CO2、湿度95%で4〜12週間培養します。</li>
	<li>5日ごとに培地の半分を交換してください。 注:オルガノイドが組織培養プレートに付着し始めたら、新しいウェルに移してください。</li>
</ol>4.腎臓嚢移植
<ol><li>滅菌手術器具を準備します。</li>
	<li>基底膜マトリックスプラグの嚢下腎移植を実行します。<ol><li>8週齢のBALB/c雌レシピエントマウスにイソフルランを投与し、動物倫理ガイドラインに従って麻酔をかけます。 注意:イソフルランは有害物質です。排ガスは、作業環境への侵入を防ぐために清掃する必要があります。</li>
		<li>マウスを右横置きにします。</li>
		<li>手術部位の毛を剃り、施設のガイドラインに従って皮膚を消毒します。 注意: 手術部位は、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースとアルコールベースのスクラブを交互に使用して円を描くように3回消毒することをお勧めします。</li>
		<li>脊椎に垂直に皮膚を2cm切開し、腹壁を露出させます。 注意: 皮膚の切開には、細かい手術用ハサミまたはメスの刃を使用できます。使用者は、施設の動物倫理ガイドラインまたは標準作業手順に従う必要があります。</li>
		<li>腎臓の上の腹壁に0.5cmの小さな切開を行います。 注:切開は、移植中に腎臓が外部化されたままになるように、腎臓の幅に近づける必要があります。</li>
		<li>親指と人差し指を使って下向きの圧力をかけることにより、腹膜開口部から腎臓を外部化します。一対のリングピンセットを使用して、外在化を補助することができます。綿棒を使用して滅菌PBSを定期的に塗布することにより、手順全体を通して腎臓が湿っていることを確認してください。</li>
		<li>実体顕微鏡下で、腎臓の片方の極にある一対の曲がった超微細鉗子で腎臓嚢の腎周囲脂肪をつまみます。2組目の曲がった超微細鉗子を使用して、腎臓嚢膜を反対方向に上向きにそっと引き裂き、小さな開口部を作ります。</li>
		<li>片方の鉗子の突起をカプセル膜の下に慎重に挿入します。ゆっくりとしたスイープ動作を使用して、カプセル膜を腎臓実質から分離します。</li>
		<li>ピペットチップから実験用フィルムを剥がして、移植用の基底膜マトリックスプラグを準備します。</li>
		<li>鉗子の片方のプロングを使用して腎臓カプセルを持ち上げ、ピペットチップを開口部に挿入し、腎臓の反対側の極に向かって押します。.</li>
		<li>ワイヤープランジャーをピペットチップに挿入し、マトリックスプラグを排出すると同時に、ピペットチップを腎臓から引き出します。</li>
		<li>PBSで腎臓を湿らせ、再内在化します。</li>
		<li>腹壁を5-0 Vicryl縫合糸1本で閉じ、オートクリップ2本で皮膚を閉じます。</li>
		<li>鎮痛剤(0.05-0.1 mg / kgのブプレノルフィンを皮下投与するか、施設動物倫理ガイドラインに従って投与します)。. 注意: ブプレノルフィンは有害物質であり、適切な個人用保護具で取り扱う必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>イソフルランの流れを止めますが、酸素の流れはオンのままにして、マウスが意識を取り戻し始めるまで純粋な酸素を呼吸できるようにします。</li>
	<li>マウスをケージに戻します。回復中は、ケージを加熱パッドの上またはヒートランプの下に部分的に置いて動物を暖かく保ち、マウスが麻酔から完全に回復するまで監視します。</li>
	<li>最初の2週間、または施設のガイドラインで要求されているように、術後の回復を監視します。</li>
</ol>

<ol><li>Jarcho, S., Andersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+autotransplantation+of+splenic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Traumatic autotransplantation of splenic tissue.</a> American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).</li>
<li>Storsteen, K. A., ReMine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rupture+of+the+spleen+with+splenic+implants%3A+splenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis.</a> Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).</li>
<li>Mizrahi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttraumatic+autotransplantation+of+spleen+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue.</a> Archives of Surgery. 124 (7), 863(1989).</li>
<li>Miko, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+autotransplantation.+Morphological+and+functional+follow-up+after+spleen+autotransplantation+in+mice%3A+A+research+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary.</a> Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).</li>
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<li>Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoarchitecture+of+regenerated+splenic+and+lymph+node+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants.</a> International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).</li>
<li>Tan, J. K. H., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+spleen+tissue+regeneration+from+neonatal+spleen+capsule+requires+lymphotoxin+priming+of+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells.</a> The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).</li>
<li>Tan, J. K. H., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+subsets+directing+neonatal+spleen+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration.</a> Scientific Reports. 7 (1), 40401(2017).</li>
<li>Gee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+organoid+units+generate+functional+human+and+mouse+tissue-engineered+spleen+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model.</a> Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).</li>
<li>Ueno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+Tlx1+marks+a+subset+of+lymphoid+tissue+organizer-like+mesenchymal+progenitor+cells+in+the+neonatal+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20408(2019).</li>
<li>Tourle, K., Rucinski, A., Grainger, A., Limnios, I. J., Gonzalez Ruiz, M., Tan, J. K. H. Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01">https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01</a> (2023).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

半固体培地内での新生児脾臓細胞の凝集は、脾臓構築物を生成するための実行可能な方法である。同様の基底膜マトリックスベースのプロトコルが、3次元脾臓培養を開始するために使用されている10。ここでは、脾臓構造物が in vitro オルガノイド培養システムと in vivo 移植モデルに等しく従順であることを実証します。注目すべきは、 in vitro 培養脾臓オルガノイドの移植はまだテストされていないことですが、脾臓組織の完全または部分的な再生能力を決定することは興味深いことです。このプロトコルはまた前の脾臓の移植の調査8で記述されているセル凝集の技術を受継ぐ。これらの研究では、コラーゲンシート上に細胞凝集体をロードし、腎臓嚢の下に移植しました。基底膜マトリックス内に細胞凝集体を包み込むことは、コラーゲンシート側を下向きにした場合と細胞凝集体側を下向きにした場合の移植に伴うばらつきが排除される、移植片の配向という点で明確な利点があります。
基底膜マトリックスコンストラクトを調製する方法は比較的簡単です。高濃度の基底膜マトリックスを使用することで、マトリックスが数日かけて消散する前に、細胞が最初に凝集した状態で支持されることが保証されます。私たちの経験では、PBS懸濁細胞溶液の慎重な層状化(ステップ2.6)と遠心分離(ステップ2.8)の後、基底膜マトリックスの混合と希釈は最小限に抑えられます。ほとんどの最適化は、マトリックスプラグ内のセルペレットの配置を中心に行われます(図1)。これは、遠心分離速度、時間、基底膜マトリックスの体積組成、PBS懸濁細胞溶液の体積、ピペットチップサイズなど、いくつかの変数をテストすることで対処できます。細胞数と特性(サイズ、密度)も設定に影響を与える可能性があるため、各細胞調製は個別に最適化する必要があります。
いくつかの制限事項を強調することが重要です。基底膜マトリックスは温度に敏感な製品である可能性があるため、試薬を冷たく保つために迅速に作業するように注意する必要があります。これにより、マトリックスの早期凝固を防ぎ、細胞の適切なカプセル化を確実にします。関連するすべての材料は低温環境で保管、調製、または維持されますが、手動の取り扱い手順(ピペットチップの排出、柔軟なラボ用フィルムによる密封[ステップ2.5]など)により、ユーザーからの外部熱が変動し、マトリックスの粘度が変化し、遠心分離中の細胞移動特性に影響を与える可能性があります。したがって、実験内および実験間の再現性を一貫して達成することは困難な場合があります。
2つ目の制限は、ユーザーエクスペリエンスと習熟度の要件です。特定の手動テクニックは、効率的かつ成功裏に実行するために長時間のトレーニングを必要とする場合があります。例えば、ピペットチップを実験用フィルムで密封する場合(ステップ2.5)、最初は成功率が低くなる可能性がありますが、練習を重ねることで必然的に改善されます。動物のマイクロサージェリー技術の能力も反復によって得られます。移植の場合、特にピペットチップを腎臓カプセルの下に挿入する場合(ステップ4.2.10)、ワイヤープランジャーを挿入してプラグを排出する場合(ステップ4.2.11)、およびチップを腎臓から引き抜く場合は注意が必要です。プラグを静かに着実に排出し、同時にピペットチップを引き抜くことが重要です。過度の動きは、腎臓嚢に穴が開いたり、実質が損傷したりして、過度の出血につながる可能性があります。
要約すると、半固体マトリックス内に細胞をカプセル化するプロセスは、脾臓組織形成の理解に焦点を当ててここで説明されています。このシステムは、in vitro または in vivo のダウンストリームアプリケーションの可能性を秘めた幅広い細胞タイプにも同様に適用できます。

脾臓の外傷性破裂と体内の複数の脾臓結節の出現は、脾臓組織が再生能力を持っていることを示す最初の兆候の1つでした1,2。脾臓自家移植は、緊急脾臓摘出術を必要とする患者の脾臓組織を保存するために、後にクリニックに導入されました3。しかし、何十年にもわたって臨床診療の一部となっているにもかかわらず、脾臓がどのように再生するかについてはほとんど知られていません。動物移植モデルは、脾臓の再生と免疫機能の複数のパラメータに関する洞察を与えてきました4,5。特に、移植片調製法の実験的変更により、組織再生を細胞および分子レベルでより詳細に研究できるようになりました。
脾臓全切片を含む移植は、新しい脾臓構造が再構築される前に、大量壊死の段階を経る6。移植片壊死の初期段階は、移植された組織の大部分が赤血球と白血球で構成されており、脾臓の再生には不要であることを示唆しています。これは、マウス腎臓嚢の下に移植する前に、脾臓移植片から造血細胞を除外することによって実験的に調査されました。ここで、間質細胞と内皮細胞を含む脾臓の非白血球/非赤血球画分は、de novo組織形成を誘導するのに十分であることが示された7。脾臓間質組織をさらに単一細胞懸濁液に加工することで、細胞移植片の組成を操作するための細胞選別技術の使用が可能になります。候補細胞型を選択的に除去することにより、移植片の発生に不可欠な2つのCD45-TER-119-間質細胞集団、すなわち内皮様CD31+CD105+MAdCAM-1+細胞集団と、より広義のPDGFRβ+間葉系細胞集団が同定された8。
脾臓細胞からの移植片の構築は、支持体と細胞ローディングプロセスの点で異なります。組織工学的脾臓は、脾臓ユニットをポリグリコール酸/ポリL乳酸ポリマー足場5,9にロードすることによって以前に調製されてきました。興味深いことに、コラーゲンスポンジに吸収された脾臓間質細胞は生着に失敗し、間質細胞が凝集してコラーゲンシート上にロードされると、脾臓の再生が促進されました8。マトリゲル基底膜マトリックス内の脾臓間質細胞の再懸濁も、3次元培養条件下で細胞凝集を誘導することが実証されている10。ただし、この方法は移植モデルでの使用についてはテストされていません。現在のプロトコルの全体的な目標は、脾臓間質細胞を基底膜マトリックス内に強制的に凝集して直接カプセル化することであり、その後、3次元のin vitro組織培養システムに移したり、動物モデル移植の媒体として使用したりできます(補足図1)。

<table><tbody><tr><td>96ウェルポリプロピレン1.2 mLクラスターチューブ</td><td>コーニング</td><td>CLS4401</td><td>14 mlコニカルチューブ内に置くため</td></tr><tr><td>B-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>ストック 55 mM、50 uMで使用</td></tr> コ<tr><td>ラゲナーゼD</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I(DNase I)</td>から<td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td>デオキシリボヌクレアーゼ I ウシ膵臓由来、II-S 型、凍結乾燥粉末、タンパク質 &ge;80%&ge;2,000単位/mgタンパク質</td></tr><tr><td>ダルベッコ'のモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>4500 mg/L グルコース、L-グルタミン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウムなし、液体。滅菌フィルター付き。</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>塩化カルシウムと塩化マグネシウムなし、滅菌ろ過された</td></tr><tr><td>Eclipse 200 &mu;l ピペットチップ</td><td>Labcon</td><td>1030-260-000</td><td>ベベルポイント</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>Lot# 1382243</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Stock 100X, use at 1X</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354263</td><td>Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186</td></tr><tr><td>MEM Non-essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>ストック100X、1X</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>で</td>使用 <td>15140122ストック10,000ユニット/ mlペニシリン、10,000 ug / mlストレプトマイシン</td></tr><tr><td>可逆細胞ストレーナーSTEMCELL</td><td>Technologies</td><td>27216</td><td>70 &mu;m</td></tr><tr><td>リングピンセット</td><td>NAPOX</td><td>A-26</td><td>リングサイズ:3 mm</td></tr><tr><td>ロックインヒビター (Y-27632)</td><td>MedChemExpres</td><td>HY-10071</td><td></td></tr><tr><td>サーモフィッシャー ヘレウス メガフュージ 40R 遠心分離</td>機 <td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>加速速度と減速速度は 8 個に設定しました</td></tr><tr>ウルトラ<td>ファインピンセット</td><td>EMS</td><td>78340-51S</td><td>スタイル51S。耐磁性/抗酸SA低炭素オーステナイト鋼ピンセットは耐腐食性があります。アンチグレアサテン仕上げ。</td></tr><tr><td>Vicryl 5/0縫合糸Ligapak</td>リール<td>Ethicon</td><td>J283G</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol IIロングワイヤープランジャー</td>ドラ<td>モンド</td><td>5-000-2002-L</td><td>ステンレス鋼プランジャー、25&50 &L/WRTL II, ロング&nbsp;</td></tr><tr><td>傷クリップアプラ</td><td>イヤーMikRon</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>傷口クリップ</td><td>MikRon</td><td>427631</td><td>9 mm</td></tr></tbody></table>

マウス脾臓組織形成研究のための基底膜マトリックスカプセル化細胞凝集

Basement Membrane Matrix Encapsulated Cell Aggregation for Investigating Murine Spleen Tissue Formation

脾臓は、血液媒介性免疫応答に重要な役割を果たす免疫器官です。この組織の解剖学的または機能的な喪失は、重度の血液感染症および敗血症に対する感受性を高める。脾臓切片の自家移植は、失われた組織を補充し、免疫機能を回復させるために臨床的に使用されています。しかし、堅牢で免疫学的に機能する脾臓組織の再生を促進するメカニズムは完全には解明されていません。本研究では、脾臓細胞を半固体マトリックス内に凝集・カプセル化する方法を開発し、脾臓組織形成に必要な細胞を解明することを目指しています。基底膜マトリックスカプセル化された細胞コンストラクトは、三次元オルガノイドの in vitro 組織培養と、 in vivo 組織形成を直接評価するための腎臓カプセル下移植の両方に適しています。インプット細胞の凝集とカプセル化を操作することで、移植モデル動物移植モデルにおける脾臓組織の再生には、移植片由来のPDGFRβ+MAdCAM-1- 新生児間質細胞が必要であることを実証しました。

細胞凝集は、細胞間の接触とシグナル伝達を促進するために重要です。基底膜マトリックス内に細胞凝集体を包むことで、 in vitro 組織オルガノイド形成のための3次元培養と、移植片移植のための腎カプセルへの細胞の機械的送達の両方が容易になりました。これらの構造を確立するために、まず基底膜マトリックスを氷冷条件下で流動状態に維持しました。その後、濃縮された細胞懸濁液を上に重ね、遠心力を利用して細胞を高密度マトリックスに押し込むことで、細胞凝集を達成しました。遠心分離速度(200-2000 x g)の最適化は、中間層のセルポジショニング(図1A)を達成するために必要であり、これも細胞数に依存していました。より高い遠心力(&gt;500 x g)は、細胞をピペットの先端まで押し出し(図1B)、柔軟な実験用フィルムカバーの除去中に失われる可能性のある細胞数が小さい(つまり、&lt;5 x 105)には注意が必要です。逆に、G力が低すぎる場合(≤200 x g)、細胞は基底膜マトリックスを十分に通過できない可能性があります(図1C)。細胞番号 &lt;1 x 105 または &gt;2.5 x 106 の遠心分離速度は、さらに最適化が必要な場合があります。遠心分離後、コンストラクトを37°Cで15分間加温することにより、細胞を基底膜マトリックス内にセットしました。この凝固プロセスにより、細いワイヤープランジャーを使用してマトリックスの「プラグ」を完全に排出することができました(図1D)。
in vitro 脾臓オルガノイド形成 適切な組織培養容器に注入された基底膜マトリックスプラグは、標準的な組織培養技術および条件(37°C、5%CO2、湿度95%)に従って維持できる3次元オルガノイド様構造を再現性よく形成しました11。培養では、支持基底膜マトリックス基質は0日目から14日目の間に徐々に消失し(図2A、i-iii)、21日目までに観察できなくなり、直径約545μm(s.d.=120μm、n=6)11の無傷のオルガノイド様球状細胞塊(図2A、vi)が残った。これらのオルガノイド構造は、30日を超えて培養で支持されましたが、時間の経過とともにサイズは増加しませんでした(図2B)。脾臓オルガノイドは、CD45-TER-119-間質細胞、CD45-TER-119+赤血球、およびCD45+TER-119-リンパ球で構成されていましたが(図2C)、各集団の頻度は個々のオルガノイド間で異なっていました(n = 4;表1)。脾臓オルガノイドの一般的な構造を評価するために、厚さ50 μmの組織凍結切片を調製し、可視化しました。オルガノイドは非中空構造で構成されており、細胞は組織の直径全体にわたって存在していました(図2D)。7 μmの単一細胞層の厚さでオルガノイド切片を評価したところ、細胞は明確な空間的配向を伴わずにコード状の構造に配置されており(図2D)、細胞ストリング間に核のない領域があることが明らかになりました。CD45抗体染色により、オルガノイドの末梢領域を密に取り囲む有核造血細胞の存在が確認されました(図2E)。さらに、異なる紡錘形の形態のCD45+細胞が、より中心的なオルガノイド領域で観察された。CD90.2(T細胞)およびCD19(B細胞)抗体染色は全般的に認められず、CD11b染色は陽性であったことから、骨髄系細胞の特異的存在が実証されました(図2F)。非造血CD105+およびCD31+内皮細胞も複数のオルガノイドで検出された11。
生体内 脾臓移植 凝集した脾臓間質細胞を半固体マトリックス内にカプセル化することで、動物移植研究が容易になります。この技術を使用して、未分画またはCD45-TER-119-FACSで選別された新生児脾臓間質細胞調製物を基底膜マトリックスプラグ内に埋め込み、マウス腎臓嚢の下に移植するための媒体として機能しました。同様の細胞凝集プロトコル8に沿って、基底膜マトリックスカプセル化細胞コンストラクト(MECC)は、4/5の独立した動物移植で脾臓組織を再生することに成功し、それによってこの移植片構築技術の実行可能性が確認されました。脾臓再生に必要な細胞型を定義する際のMECCの有用性をテストするために、PDGFRβ+MAdCAM-1+またはPDGFRβ+MAdCAM-1-間質(CD45-)細胞が特異的に枯渇した新生児脾臓細胞からMECC移植片が構築されました11。PDGFRβ+MAdCAM-1+細胞を欠損した移植片は、肉眼的組織再生能力を保持していた(4/4移植片;図3A)11.再生された4つの組織のうち3つが正常な脾臓細胞の組成と構造を示し、中央細動脈、白歯髄卵胞、分離されたT細胞およびB細胞区画、濾胞樹状細胞、辺縁帯網状細胞、および辺縁金属親和性マクロファージ、赤髄正弦波、骨髄細胞およびマクロファージを示しました(図3B)11。対照的に、PDGFRβ+MAdCAM-1-細胞を欠損した移植片は、脾臓組織の再生にほとんど失敗しました(1/4移植片)11。これらのデータは、脾臓組織再生における移植片由来のPDGFRβ+細胞の重要性を裏付けており8、PDGFRβ+MAdCAM-1-間質細胞の特異的な要件をピンポイントで示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66682/66682fig01.jpg"> 図 1.凝集した脾臓間質細胞の基底膜マトリックスカプセル化。 200 μLのピペットチップを使用して、基底膜マトリックス内での細胞凝集を促進します。まず、氷冷した基底メンブレンマトリックス 2 μL を事前に冷却したピペットチップに吸引することによって、流体マトリックス層が確立されます。細胞懸濁液をマトリックス層の上に堆積させ、遠心力を加えることで、基底膜マトリックス内で細胞を動員・凝集させます。(A)遠心分離速度の設定は、細胞凝集体をマトリックス層の中間に配置するように最適化されています。(B)遠心速度が大きすぎると、ピペットの最後に細胞が凝集します。(C)速度が不十分な場合、マトリックスを通る細胞の移動が妨げられます。(D)37°Cで15分間インキュベートした後、ピペットチップから半固体マトリックスプラグを排出します。矢印は、マトリックス内のセル集合体の配置を示します。スケールバー、100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/66682fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66682/66682fig02.jpg"> 図 2.基底膜マトリックスに封入された脾臓凝集体のin vitro培養と3次元オルガノイド構造の形成。(A)35日間の時間経過にわたる脾臓オルガノイドの発達。パネル(i-vi)は、培養の0、7、14、21、28、および35日目に対応します。画像はニコンTS2倒立位相差顕微鏡で撮影しました。スケールバー、500 μm。 (B)長期培養期間にわたる脾臓オルガノイド径。各線は個々のオルガノイドを表します。(C)間質細胞(CD45-TER-119-)、リンパ球(CD45+TER-119-)、赤血球(CD45-TER-119+)細胞集団の53日間の培養後のフローサイトメトリーによる特性評価。上段:新生児脾臓間質から調製した対照組織。下段:脾臓オルガノイド、52日目。(D)培養22日後の切片の厚さ50 μm(上段)および7 μm(下段)のオルガノイド組織の肉眼的形態。(E)培養34日後のCD45+造血細胞の局在と形態。拡大された領域は右側のパネルに表示されます。切片は7μmです。 (F)培養34日後の骨髄系(CD11b)、T(CD90.2)およびB(CD19)細胞の評価。拡大した領域を挿入図で表示します。切片は7μmです。画像はNikon Eclipse Ti2-E生細胞顕微鏡を使用して撮影しました。スケールバー(D、E、F)、100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/66682fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66682/66682fig03.jpg"> 図 3.基底膜マトリックスグラフト組織分析。 移植片は、PDGFRβ+MAdCAM-1+ 細胞(n = 4)が枯渇した新生児脾臓間質から構築されました。オンラインで入手可能な追加データ11.(A)腎嚢下での移植後4週間での再生脾臓移植片の肉眼的外観。黄色の枠内領域は、再生された脾臓組織を示します。この画像は、Snapズームアダプターを装着したライカM60実体顕微鏡とApple iPhone 6Sを使用して撮影されました。スケールバー、1000 μm。 (B)冠状面に凍結切片された厚さ30 μmの移植片組織の複合マルチカラー免疫蛍光画像。抗体染色は、脾臓組織の微細構造を可視化するために、示されたマーカーで実施されました。画像はNikon Eclipse Ti2-E生細胞顕微鏡を使用して撮影しました。四角い領域は、倍率の高い領域を示します。スケールバー、1000 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/66682fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>オルガノイド番号</td>
			<td>間質細胞</td>
			<td>赤血球</td>
			<td>リンパ 球</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>62</td>
			<td>7.7</td>
			<td>31</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>22</td>
			<td>24</td>
			<td>55</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>3.6</td>
			<td>0.1</td>
			<td>96</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>76</td>
			<td>12</td>
		</tr></tbody></table>表 1.個々の脾臓オルガノイドにおける間質細胞、赤血球およびリンパ球集団の割合。
補足図1.in vitroおよびin vivo研究用のマトリックス埋め込みセルコンストラクトを生成するための主要なステップを強調するプロトコルの概略図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/Supplemantary%20Figure%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

この記事は半固体基底の膜のマトリックス内の脾臓のセルを凝集し、カプセル封入するためのプロトコルを記述する。基底膜マトリックスコンストラクトは、オルガノイド発生の研究、または in vivo 移植および組織再生研究のための三次元培養に使用できます。

The spleen is an immune organ that plays a key role in blood-borne immune responses. The anatomical or functional loss of this tissue increases ...

このプロトコルの全体的な目標は、半固体マトリックス内のセルを集約して包むことです。包埋された細胞凝集体は、下流の3次元in vitro培養で、またはin vivo移植実験の媒体として使用することができます。この方法の主な利点は、シンプルな方法論と装置を使用して細胞凝集を実現することです。また、さまざまな細胞の種類や数にも適用できます。この技術により、脾臓の再生に必要な特定の細胞タイプが明らかになりました。これは、脾臓組織再生のさらなる調節因子を明らかにしたり、より広範な組織工学研究のプラットフォームとして機能したりする可能性があります。まず、マイナス20°Cの冷凍庫で200マイクロリットルのピペットチップボックスを事前に冷やします。次に、パラフィルムを80%エタノールに10分間浸し、続いてPBSで10分間洗浄します。細胞溶液を調製するには、目的の細胞番号を14ミリリットルのコニカルチューブに分注します。細胞を200g、摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清を慎重に吸引し、約20マイクロリットルの体積を残します。その後、細胞ペレットは、残りの上清量に再懸濁することができます。あらかじめ冷やしたピペットチップを使用して、氷冷したマトリゲルを2マイクロリットル吸引します。静かにひねって取り出し、ピペットチップを取り外します。滅菌済みのパラフィルムのストリップを伸ばし、フィルムに穴を開けないように注意しながら、ピペットチップの端に置きます。パラフィルムを側面に巻き付け続けて、先端が密閉されていることを確認します。次に、細胞溶液をマトリゲルの上に静かに重ねます。ピペットチップを氷の上に置いておき、1.2ミリリットルのクラスターチューブを内側に入れた14ミリリットルのコニカルチューブを準備します。その後、ピペットチップをネストチューブ構成内に挿入し、400g、摂氏4度で5分間遠心分離します。チューブを摂氏37度で15分間インキュベートします。チューブは、さらに必要になるまで氷上に置くことができます。ピペットチップからパラフィルムを慎重に取り除き、細いワイヤープランジャーを挿入し、マトリゲルプラグを組織培養培地に排出します。凝集した細胞は、摂氏37度、二酸化炭素5%で培養できます。電動バリカンで毛を剃り、80%エタノールで皮膚を拭きます。脊椎に垂直に皮膚を2センチ切開し、腹壁を露出させます。次に、腎臓の上の腹壁に2番目の小さな切開を行います。圧力をかけ、腎臓を外在化します。滅菌PBSを定期的に塗布することにより、腎臓が湿っていることを確認してください。腎臓嚢を超極細鉗子でつまみ、2番目の鉗子を使用して、反対方向にそっと引き裂きます。カプセル膜を腎臓実質から慎重に分離します。1組の鉗子で腎臓カプセルを持ち上げ、ピペットチップを開口部からゆっくりとスライドさせます。ワイヤープランジャーをピペットチップにそっと挿入し、マトリゲルプラグを排出します。PBSで腎臓を湿らせ、腹腔に再内在化します。腹壁を5-O-Vicryl縫合糸で閉じ、AutoClipアプライヤーと2つの9mm創傷クリップを使用して皮膚切開部を閉じます。このプロトコルの重要なステップは、半固体マトリックス内の細胞を集約することです。中間層の位置決めは、最適な遠心分離速度によって達成されます。速度を上げると細胞がピペットの先端まで押し出され、速度が不十分な場合、マトリックスを通る細胞の移動が妨げられます。凝固後、マトリゲル構造物をピペットチップから排出することができます。in vitroで培養された脾臓間質構造物は、3次元の球状オルガノイド構造を形成します。オルガノイドは、組織の直径全体にわたって細胞が存在する非中空構造を示します。それらは、白血球、赤血球、非造血間質細胞および内皮細胞を含む3つの広範な細胞集団で構成されています。また、組織再生研究のために腎臓嚢の下に構築物を移植することもできます。4週間後、中枢細動脈、B細胞濾胞、線維芽細胞性網状細胞、赤歯髄骨髄細胞、辺縁帯金属親和性マクロファージ、赤歯髄正弦波、濾胞樹状細胞ネットワーク、T細胞帯、赤髄マクロファージ、辺縁帯網状細胞など、組織化された脾臓組織構造が観察されます。細胞の凝集とカプセル化を試みる際には、迅速に作業し、すべての材料を氷上に置いておくことを忘れないことが重要です。移植の最も重要なステップは、ピペットチップを腎臓から引き抜きながら、マトリゲルプラグを排出することです。カプセル膜に穴を開けたり、腎臓実質を破裂させたりしないように注意する必要があります。このプロトコルが脾臓のティッシュ再生の2つの間質のセル集団のための条件を調査するのに使用された。この代表的な実験では、血小板由来成長因子受容体β陽性MAdCAM陰性細胞が枯渇した凝集体のみが組織増殖を開始できなかったことから、この特定の細胞集団が脾臓の再生に不可欠であることが示唆されました。

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Research

JoVE Journal

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