マウス脾臓組織形成研究のための基底膜マトリックスカプセル化細胞凝集

このプロトコルの全体的な目標は、半固体マトリックス内のセルを集約して包むことです。包埋された細胞凝集体は、下流の3次元in vitro培養で、またはin vivo移植実験の媒体として使用することができます。この方法の主な利点は、シンプルな方法論と装置を使用して細胞凝集を実現することです。

また、さまざまな細胞の種類や数にも適用できます。この技術により、脾臓の再生に必要な特定の細胞タイプが明らかになりました。これは、脾臓組織再生のさらなる調節因子を明らかにしたり、より広範な組織工学研究のプラットフォームとして機能したりする可能性があります。

まず、マイナス20°Cの冷凍庫で200マイクロリットルのピペットチップボックスを事前に冷やします。次に、パラフィルムを80%エタノールに10分間浸し、続いてPBSで10分間洗浄します。細胞溶液を調製するには、目的の細胞番号を14ミリリットルのコニカルチューブに分注します。

細胞を200g、摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清を慎重に吸引し、約20マイクロリットルの体積を残します。その後、細胞ペレットは、残りの上清量に再懸濁することができます。

あらかじめ冷やしたピペットチップを使用して、氷冷したマトリゲルを2マイクロリットル吸引します。静かにひねって取り出し、ピペットチップを取り外します。滅菌済みのパラフィルムのストリップを伸ばし、フィルムに穴を開けないように注意しながら、ピペットチップの端に置きます。

パラフィルムを側面に巻き付け続けて、先端が密閉されていることを確認します。次に、細胞溶液をマトリゲルの上に静かに重ねます。ピペットチップを氷の上に置いておき、1.2ミリリットルのクラスターチューブを内側に入れた14ミリリットルのコニカルチューブを準備します。

その後、ピペットチップをネストチューブ構成内に挿入し、400g、摂氏4度で5分間遠心分離します。チューブを摂氏37度で15分間インキュベートします。チューブは、さらに必要になるまで氷上に置くことができます。

ピペットチップからパラフィルムを慎重に取り除き、細いワイヤープランジャーを挿入し、マトリゲルプラグを組織培養培地に排出します。凝集した細胞は、摂氏37度、二酸化炭素5%で培養できます。電動バリカンで毛を剃り、80%エタノールで皮膚を拭きます。

脊椎に垂直に皮膚を2センチ切開し、腹壁を露出させます。次に、腎臓の上の腹壁に2番目の小さな切開を行います。圧力をかけ、腎臓を外在化します。

滅菌PBSを定期的に塗布することにより、腎臓が湿っていることを確認してください。腎臓嚢を超極細鉗子でつまみ、2番目の鉗子を使用して、反対方向にそっと引き裂きます。カプセル膜を腎臓実質から慎重に分離します。

1組の鉗子で腎臓カプセルを持ち上げ、ピペットチップを開口部からゆっくりとスライドさせます。ワイヤープランジャーをピペットチップにそっと挿入し、マトリゲルプラグを排出します。PBSで腎臓を湿らせ、腹腔に再内在化します。

腹壁を5-O-Vicryl縫合糸で閉じ、AutoClipアプライヤーと2つの9mm創傷クリップを使用して皮膚切開部を閉じます。このプロトコルの重要なステップは、半固体マトリックス内の細胞を集約することです。中間層の位置決めは、最適な遠心分離速度によって達成されます。

速度を上げると細胞がピペットの先端まで押し出され、速度が不十分な場合、マトリックスを通る細胞の移動が妨げられます。凝固後、マトリゲル構造物をピペットチップから排出することができます。in vitroで培養された脾臓間質構造物は、3次元の球状オルガノイド構造を形成します。

オルガノイドは、組織の直径全体にわたって細胞が存在する非中空構造を示します。それらは、白血球、赤血球、非造血間質細胞および内皮細胞を含む3つの広範な細胞集団で構成されています。また、組織再生研究のために腎臓嚢の下に構築物を移植することもできます。

4週間後、中枢細動脈、B細胞濾胞、線維芽細胞性網状細胞、赤歯髄骨髄細胞、辺縁帯金属親和性マクロファージ、赤歯髄正弦波、濾胞樹状細胞ネットワーク、T細胞帯、赤髄マクロファージ、辺縁帯網状細胞など、組織化された脾臓組織構造が観察されます。細胞の凝集とカプセル化を試みる際には、迅速に作業し、すべての材料を氷上に置いておくことを忘れないことが重要です。移植の最も重要なステップは、ピペットチップを腎臓から引き抜きながら、マトリゲルプラグを排出することです。

カプセル膜に穴を開けたり、腎臓実質を破裂させたりしないように注意する必要があります。このプロトコルが脾臓のティッシュ再生の2つの間質のセル集団のための条件を調査するのに使用された。この代表的な実験では、血小板由来成長因子受容体β陽性MAdCAM陰性細胞が枯渇した凝集体のみが組織増殖を開始できなかったことから、この特定の細胞集団が脾臓の再生に不可欠であることが示唆されました。