マウス脾臓組織形成研究のための基底膜マトリックスカプセル化細胞凝集
June 28th, 2024
この記事は半固体基底の膜のマトリックス内の脾臓のセルを凝集し、カプセル封入するためのプロトコルを記述する。基底膜マトリックスコンストラクトは、オルガノイド発生の研究、または in vivo 移植および組織再生研究のための三次元培養に使用できます。
このプロトコルの全体的な目標は、半固体マトリックス内のセルを集約して包むことです。包埋された細胞凝集体は、下流の3次元in vitro培養で、またはin vivo移植実験の媒体として使用することができます。この方法の主な利点は、シンプルな方法論と装置を使用して細胞凝集を実現することです。
また、さまざまな細胞の種類や数にも適用できます。この技術により、脾臓の再生に必要な特定の細胞タイプが明らかになりました。これは、脾臓組織再生のさらなる調節因子を明らかにしたり、より広範な組織工学研究のプラットフォームとして機能したりする可能性があります。
まず、マイナス20°Cの冷凍庫で200マイクロリットルのピペットチップボックスを事前に冷やします。次に、パラフィルムを80%エタノールに10分間浸し、続いてPBSで10分間洗浄します。細胞溶液を調製するには、目的の細胞番号を14ミリリットルのコニカルチューブに分注します。
細胞を200g、摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清を慎重に吸引し、約20マイクロリットルの体積を残します。その後、細胞ペレットは、残りの上清量に再懸濁することができます。
あらかじめ冷やしたピペットチップを使用して、氷冷したマトリゲルを2マイクロリットル吸引します。静かにひねって取り出し、ピペットチップを取り外します。滅菌済みのパラフィルムのストリップを伸ばし、フィルムに穴を開けないように注意しながら、ピペットチップの端に置きます。
パラフィルムを側面に巻き付け続けて、先端が密閉されていることを確認します。次に、細胞溶液をマトリゲルの上に静かに重ねます。ピペットチップを氷の上に置いておき、1.2ミリリットルのクラスターチューブを内側に入れた14ミリリットルのコニカルチューブを準備します。
その後、ピペットチップをネストチューブ構成内に挿入し、400g、摂氏4度で5分間遠心分離します。チューブを摂氏37度で15分間インキュベートします。チューブは、さらに必要になるまで氷上に置くことができます。
ピペットチップからパラフィルムを慎重に取り除き、細いワイヤープランジャーを挿入し、マトリゲルプラグを組織培養培地に排出します。凝集した細胞は、摂氏37度、二酸化炭素5%で培養できます。電動バリカンで毛を剃り、80%エタノールで皮膚を拭きます。
脊椎に垂直に皮膚を2センチ切開し、腹壁を露出させます。次に、腎臓の上の腹壁に2番目の小さな切開を行います。圧力をかけ、腎臓を外在化します。
滅菌PBSを定期的に塗布することにより、腎臓が湿っていることを確認してください。腎臓嚢を超極細鉗子でつまみ、2番目の鉗子を使用して、反対方向にそっと引き裂きます。カプセル膜を腎臓実質から慎重に分離します。
1組の鉗子で腎臓カプセルを持ち上げ、ピペットチップを開口部からゆっくりとスライドさせます。ワイヤープランジャーをピペットチップにそっと挿入し、マトリゲルプラグを排出します。PBSで腎臓を湿らせ、腹腔に再内在化します。
腹壁を5-O-Vicryl縫合糸で閉じ、AutoClipアプライヤーと2つの9mm創傷クリップを使用して皮膚切開部を閉じます。このプロトコルの重要なステップは、半固体マトリックス内の細胞を集約することです。中間層の位置決めは、最適な遠心分離速度によって達成されます。
速度を上げると細胞がピペットの先端まで押し出され、速度が不十分な場合、マトリックスを通る細胞の移動が妨げられます。凝固後、マトリゲル構造物をピペットチップから排出することができます。in vitroで培養された脾臓間質構造物は、3次元の球状オルガノイド構造を形成します。
オルガノイドは、組織の直径全体にわたって細胞が存在する非中空構造を示します。それらは、白血球、赤血球、非造血間質細胞および内皮細胞を含む3つの広範な細胞集団で構成されています。また、組織再生研究のために腎臓嚢の下に構築物を移植することもできます。
4週間後、中枢細動脈、B細胞濾胞、線維芽細胞性網状細胞、赤歯髄骨髄細胞、辺縁帯金属親和性マクロファージ、赤歯髄正弦波、濾胞樹状細胞ネットワーク、T細胞帯、赤髄マクロファージ、辺縁帯網状細胞など、組織化された脾臓組織構造が観察されます。細胞の凝集とカプセル化を試みる際には、迅速に作業し、すべての材料を氷上に置いておくことを忘れないことが重要です。移植の最も重要なステップは、ピペットチップを腎臓から引き抜きながら、マトリゲルプラグを排出することです。
カプセル膜に穴を開けたり、腎臓実質を破裂させたりしないように注意する必要があります。このプロトコルが脾臓のティッシュ再生の2つの間質のセル集団のための条件を調査するのに使用された。この代表的な実験では、血小板由来成長因子受容体β陽性MAdCAM陰性細胞が枯渇した凝集体のみが組織増殖を開始できなかったことから、この特定の細胞集団が脾臓の再生に不可欠であることが示唆されました。
概要
この記事では、半固形の細胞基質マトリックス内に脾臓細胞を集約し、カプセル化するプロトコルについて説明しています。この技術は、オルガノイドの発生を研究するための三次元培養や、生体内移植および組織再生研究に使用できます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞集約
- 組織工学
- 再生医療
背景
- このプロトコルは、半固形マトリックス内に細胞を封入することを可能にします。
- 様々な細胞種および数に適用できます。
- この方法は、脾臓再生に必要な特定の細胞種を明らかにしました。
- より広範な組織工学研究のためのプラットフォームとして機能します。
研究の目的
- 半固形マトリックス内に脾臓細胞を集約し、封入すること。
- 三次元のインビトロ培養を容易にすること。
- 生体内移植実験を可能にすること。
使用された方法
- 脾臓細胞の集約。
- 半固形の細胞基質マトリックス内でのカプセル化。
- 簡単な方法論と機器の利用。
- 様々な細胞種への適用。
主な結果
- 脾臓細胞の成功的な集約と封入。
- 脾臓再生に必要な特定の細胞種の同定。
- 組織再生のさらなる調整因子を明らかにする可能性。
- 組織工学研究のためのプラットフォームの確立。
結論
- このプロトコルは、細胞集約のための簡単な方法を提供します。
- 脾臓組織再生の理解に影響を与えます。
- この技術は将来の組織工学研究を強化する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Basement membrane matrix encapsulated cell aggregation enables controlled investigation of cellular requirements for murine spleen tissue formation, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This platform provides predictive confidence for identifying essential stromal cell populations in tissue regeneration, directly informing target validation and tissue engineering strategies. The method's adaptability to both in vitro organoid culture and in vivo transplantation positions it as a reusable capability for regenerative medicine R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular mechanisms underlying spleen tissue regeneration.
- Supports functional validation of stromal cell populations critical for organogenesis.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating and testing specific cell types.
- Provides a platform for hypothesis-driven studies on tissue formation requirements.
Screening & Assay Development
- Prepares validated three-dimensional organoid systems for downstream analysis.
- Standardizes encapsulation and aggregation for reproducible tissue constructs.
- Generates quantitative outputs on organoid structure and cellular composition.
- Enables scalable evaluation of cell population contributions to tissue formation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro and in vivo models for translational continuity in tissue engineering.
- Supports risk-adjusted advancement of regenerative strategies based on functional tissue outcomes.
- Provides a disease-relevant system for studying immune organ regeneration.
- Facilitates identification of translational biomarkers linked to successful tissue formation.
Pipeline & Workflow Integration
This encapsulation and aggregation method bridges early discovery, screening, and preclinical validation by enabling controlled manipulation and assessment of cell populations in both organoid and transplantation models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cellular drivers of spleen tissue regeneration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative organoid constructs for comparative studies.
- Analytics: Provides measurable outputs on tissue architecture and cell-type contributions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo tissue formation and functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse tissue engineering and regenerative medicine programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target cell populations for tissue regeneration.
- Operational Value: Standardizes encapsulation and aggregation for reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for advancing regenerative strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of tissue engineering approaches.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, encapsulation, and organoid culture techniques.
- Needs access to centrifugation, sterile handling, and transplantation instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across experiments.
- Adaptable to various cell types and tissue models with protocol optimization.
- Careful handling is essential to avoid tissue or organ damage during transplantation steps.
