神経膠芽腫のレーザー間質性温熱療法のための免疫適格マウスモデル

私たちの研究は、成人の脳腫瘍に焦点を当てています。これには、膠芽腫、原発性神経膠腫、および脳転移が含まれます。私たちは、これらの致命的な疾患を持つ患者に対してより効果的な治療法を特定するために、脳腫瘍マウスモデルを開発しました。

膠芽腫は、最も重篤で最も頻度の高い原発性脳腫瘍です。膠芽腫患者の20%以上で、この脳腫瘍は外科的に切除することができません。これらの場合、レーザー間質温熱療法、要するにLITTは、これらの侵攻性脳腫瘍を標的とするために臨床的に使用されます。

LITTは、外科的にアクセスできない脳腫瘍に臨床的に適用される熱組織アブレーション技術です。LITTマウスモデルを用いた研究は、腫瘍や周囲の脳組織における熱処理に対する組織や細胞の応答に関する重要な情報を提供します。LITTが脳内で引き起こす分子的および細胞的変化をより深く理解することで、LITTをより効果的に使用して脳腫瘍患者の転帰を改善することができます。

最も重要な実験的課題は、腫瘍の正確な標的化と治療です。ヒトの患者で臨床的に使用されているLITT手術とは異なり、ほとんどのモデルにはリアルタイムのMRIイメージングがないため、視覚的な補助なしに腫瘍を標的とすることは困難です。まず、麻酔をかけたマウスの体重を記録して、正しい投薬量を計算します。

目、耳、ひげを避けて、手術部位を慎重に剃ります。マウスの切歯をバイトバーの穴に配置し、定位固定装置フレームのノーズコーンをぴったりと収まるまで調整してから、固定ネジを締めて所定の位置に固定します。両側の後肢のつま先をつまんで麻酔の深さを確認します。

マウスに適切に麻酔をかけたら、耳ピンを使用して頭蓋骨を固定し、頭をニュートラルレベル平面の位置に調整します。眼科用軟膏を両目にたっぷりと塗り、乾燥を防ぎます。28ゲージのハーフインチ注射器を使用して、鎮痛剤としてメロキシカムを皮下注射します。

目標呼吸数を維持するために、麻酔率を下げます。次に、マウスを無菌的にドレープします。滅菌綿棒を使用して、内側から外側に向かって作業するクロルヘキシジン消毒液を塗布します。

次に、新鮮な滅菌綿棒を使用して、同じ方法で70%エタノールを塗布します。呼吸数を監視して、麻酔の深さを再確認してください。次に、15番のメスを使用して、目の少し後方からコドル方向に1.0〜1.5センチメートルの中央矢状切開を行います。

次に、滅菌綿棒を使用して、傷口を反射して頭蓋骨を視覚化します。その領域から結合組織をそっとこすり落とします。必要に応じて、過酸化水素に浸した滅菌綿棒を使用して頭蓋骨の表面を露出させ、ラムダ縫合糸を視覚化します。

左右の角膜縫合糸が矢状縫合糸と交わる場所にブレグマを見つけます。オプションで、LITT手術中のブレグマの移動を容易にするために、無毒の着色アクリル樹脂と滅菌木製のつまようじを使用し、ブレグマに小さな印を付けます。フレーム内のマイクロリットルシリンジで、先端がブレグマに触れる位置座標をゼロにします。

X座標は内側外側平面の動きを指し、Y座標は前方後方の動きを指し、Z座標は背側腹側平面の動きを指します。ラムダがブレグマと同じ背側腹面にあり、両方のランドマークでZがゼロに等しいことを確認します。調整が必要な場合は、滅菌綿棒で穏やかな圧力をかけ、頭蓋骨がしっかりと固定されていることを確認してください。

針先を、ブレグマから外側に 2.0 ミリメートル、前後に 0.5 ミリメートルの座標を加えた座標で、ターゲット領域上に配置します。ドリルビットの先端を頭蓋骨に接触するまで慎重に下げます。針先を少し上げ、滅菌済みの外科用マーカーを使用して、バリ穴の位置に小さな点を作ります。

次に、針を少し上げて邪魔にならないようにし、マークした場所に穴を開けます。下の髄膜を傷つけずに頭蓋骨だけでバリが発生するように注意します。プラス3.0ミリメートルの内側外側とプラス0.5ミリメートルの前後に2番目のバリ穴を作成するか、LITT手順中に熱電対を収容するために元の穴をこの座標まで延長します。次に、CT2Aマウス神経膠腫細胞が入ったマイクロ遠心チューブを氷から取り出し、指先でチューブを軽くフリックして細胞を再懸濁します。

5マイクロリットルまたは10マイクロリットルの注射器を使用して、細胞懸濁液の約2マイクロリットルを静かに引き抜きます。シリンジから0.5マイクロリットルを搾り出して、空気を取り除きます。アルコール綿棒で針の軸を拭いて、残っている液体や細胞を取り除きます。

針をZがマイナス3ミリメートルに等しい深さまでゆっくりと下げ、1分間一時停止します。次に、針を0.5ミリメートルゆっくりと引っ込め、毎分0.5マイクロリットルの速度で細胞を注入します。注射が完了したら、2分間待ってから、シリンジを3〜4分かけてゆっくりと引っ込めます。

最初の数回の間隔を100〜250マイクロメートルで終えた後、最大1分間一時停止すると、細胞の変位を防ぐのに役立ちます。創傷切開を閉じるには、切開の端を再近似します。50縫合糸で3つの断続縫合糸を使用して、傷口の端をわずかに曲げながら傷口を閉じ、下にある真皮が接触するようにします。

閉じた傷口にポビドンヨウ素溶液を塗布し、マウスを37°Cに設定された加温パッド上の紙で裏打ちされた回復ケージに移します。動物が胸骨の横臥性を取り戻したら、それはその家のケージに戻すことができます。CT2Aマウス神経膠腫細胞懸濁液を注入してから9日後、麻酔をかけたマウスを定位フレームに固定します。

正中線切開を再現し、滅菌綿棒を使用して頭蓋骨を清掃し、ブレグマを覆い隠している組織を取り除きます。レーザー間質熱療法またはLITTアタッチメントを定位フレームに取り付けた状態で、レーザーファイバーの先端のブレグマで座標をゼロにします。次に、レーザーファイバーの先端を少し上げて、目的の内側外側および前方の後ろ座標に移動します。

次に、プローブをゆっくりとターゲットの背側腹側座標まで下げて、ターゲットに到達します。LITT処理パラメータをモード連続に設定し、1つに何をパワーします。次に、レーザーをスタンバイからアクティブに切り替え、フットペダルを使用してレーザーを60秒間作動させます。

温度が摂氏46度を超えた場合は、少し一時停止してから再度取り組み、摂氏46度近くに温度を維持することを目指します。最後に、レーザーアセンブリをゆっくりと引っ込めます。レーザーファイバーと熱電対をアルコール綿棒で優しく拭きます。

アセンブリを邪魔にならないように回転させ、プローブがフレームに接触しないようにします。T2強調角膜磁気共鳴画像は、ほぼ100%の採取率で成功した腫瘍移植と一貫した球状腫瘍形成を示しました。LITT治療は、定義された高信号の黒色領域を伴う一貫したアブレーションをもたらし、中央コアの組織壊死と周術期浮腫を示す周囲の高信号白色領域を示しました。