Name: ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶヒト脳オルガノイドの作製法。iPSC由来造血前駆細胞を組み込み、ミクログリアと神経細胞を含む3Dモデルを構築し、脳発達における細胞間相互作用を研究する新たな神経科学研究ツールを提供します。

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<meta charset="utf8"></head><body>iPS細胞由来HPCを用いた常在性ミクログリアを用いたヒト脳オルガノイドの作製

<ol><li>Sabate-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+integration+into+human+midbrain+organoids+leads+to+increased+neuronal+maturation+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia integration into human midbrain organoids leads to increased neuronal maturation and functionality.</a> Glia. 70 (7), 1267-1288 (2022).</li>
<li>Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+diseases+of+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Physiology and diseases of tissue-resident macrophages.</a> Nature. 618 (7966), 698-707 (2023).</li>
<li>Wang, T., Liu, B., Zhang, W., Wilson, B., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andrographolide+reduces+inflammation-mediated+dopaminergic+neurodegeneration+in+mesencephalic+neuron-glia+cultures+by+inhibiting+microglial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Andrographolide reduces inflammation-mediated dopaminergic neurodegeneration in mesencephalic neuron-glia cultures by inhibiting microglial activation.</a> J Pharmacol Exp Ther. 308 (3), 975-983 (2004).</li>
<li>Qian, L., Flood, P. M., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+is+a+key+player+in+Parkinson%27s+disease+and+a+prime+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation is a key player in Parkinson's disease and a prime target for therapy.</a> J Neural Transm (Vienna). 117 (8), 971-979 (2010).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Fakıoğlu, D. M., Altun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+therapeutic+approaches+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">New therapeutic approaches in cystic fibrosis.</a> Turk J Pharm Sci. 17 (6), 686-697 (2020).</li>
<li>Mcmillan, R. E., Wang, E., Carlin, A. F., Coufal, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglial+models+to+study+host-virus+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human microglial models to study host-virus interactions.</a> Exp Neurol. 363, 114375(2023).</li>
<li>Scopa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jun+upregulation+drives+aberrant+transposable+element+mobilization%2C+associated+innate+immune+response%2C+and+impaired+neurogenesis+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Jun upregulation drives aberrant transposable element mobilization, associated innate immune response, and impaired neurogenesis in Alzheimer's disease.</a> Nat Commun. 14 (1), 8021(2023).</li>
<li>Tamaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+extracts+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+spread+TDP-43+pathology+in+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Spinal cord extracts of amyotrophic lateral sclerosis spread TDP-43 pathology in cerebral organoids.</a> PLoS Genet. 19 (2), e1010606(2023).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+es+and+IPS+cells+by+dual+inhibition+of+smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human es and IPS cells by dual inhibition of smad signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Kim, S. H., Chang, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+human+brain+organoids-opportunities+and+challenges+in+modeling+human+brain+development+and+neurodevelopmental+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of human brain organoids-opportunities and challenges in modeling human brain development and neurodevelopmental diseases.</a> Int J Mol Sci. 24 (15), 12528(2023).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Ormel, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+innately+develop+within+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microglia innately develop within cerebral organoids.</a> Nat Commun. 9 (1), 4167(2018).</li>
<li>Abdelmalek, C. M., et al. Building a growing genomic data repository for maternal and fetal health through the ping consortium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbdelmalek%2C+CM+%22medRxiv%22">medRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IPSC-derived+brain+organoids%3A+A+3D+mini-brain+model+for+studying+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human IPSC-derived brain organoids: A 3D mini-brain model for studying HIV infection.</a> Exp Neurol. 364, 114386(2023).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+stem+cell+function+and+neuronal+differentiation+by+HERV-K+via+mTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of stem cell function and neuronal differentiation by HERV-K via mTOR pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (30), 17842-17853 (2020).</li>
<li>Mcquade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+simplified+method+to+generate+human+microglia+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells.</a> Mol Neurodegener. 13 (1), 67(2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Fiorenzano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+captures+features+of+human+midbrain+development+and+dopamine+neuron+diversity+in+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 7302(2021).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-region-specific+organoids+using+mini-bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPS-cell-derived+microglia+promote+brain+organoid+maturation+via+cholesterol+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer.</a> Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).</li>
<li>Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchafer%2C+ST+%22Cell%22">Cell</a>. 186 (10), 2111-2126.e20 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>12ウェル細胞培養プレート</td><td>Corning&nbsp;</td><td>#3512</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>SARSTEDT</td><td>#83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 プレート</td><td>Stemcell technologies</td><td>#34411</td><td>マイクロウェル培養プレート&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス抗体</td><td>生命技術</td><td>A11001</td><td>1:400 希釈</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギ抗体</td><td>生命技術</td><td>A11012</td><td>1:400 希釈</td></tr><tr><td>Allegra X-30R ローター付き遠心分離機 S6069</td><td>ベックマン・クーラー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗接着&nbsp;リンス液</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>抗CD34抗体</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#60013</td><td>1:100 希釈</td></tr><tr><td>抗ヒトCD43抗体</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#60085</td><td>1:100 希釈</td></tr><tr><td>抗IBA1 rabbbit抗体</td><td>富士フイルム</td><td>019-19741</td><td>2.5 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>抗 TREM2&nbsp; ラット pAb</td><td>RD システム</td><td>mab17291</td><td>2.5 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1x</td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life technologies</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>CD200</td><td>Novoprotein</td><td>C311</td><td>&nbsp;100 ng/mL</td></tr><tr><td>CryoTubeバイアル</td><td>Thermo</td><td>#368632</td><td></td></tr><tr><td>CX3CL1</td><td>Peprotech</td><td>300-31</td><td>&nbsp;100 ng/mL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>D9542</td><td>1 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>#4190136</td><td>1x</td></tr><tr><td>E8 Flex medium kit</td><td>Thermo</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Mediatech</td><td>46-034-Cl&nbsp;</td><td>0.5 mM</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>EVOS FL 自動顕微鏡</td><td>熱</td><td></td><td>蛍光顕微鏡&nbsp;</td></tr><tr><td>FastStart ユニバーサル SYBR グリーン PCR マスター ミックス</td><td>ロシュ</td><td>#4913850001</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>ギブコ</td><td>#35050079</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>シグマ</td><td>G9023</td><td>4%</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>ペプロテック</td><td>200-34</td><td>&nbsp;100 ng/mL</td></tr><tr><td>ImageXpress マイクロ共焦点</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>&nbsp;25 ng/mL</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>#354277</td><td>Basement membrane matrix (BMM)</td></tr><tr><td>マウス抗β;III-チューブリン抗体</td><td>プロメガ</td><td>G712A</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 容器</td><td>サーモ</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>パラフォルマデハイド</td><td>シグマ</td><td>P6148</td><td>4%</td></tr><tr><td>PSC 神経誘導培地</td><td>Gibco</td><td>A1647801</td><td></td></tr><tr><td>Rock 阻害剤 Y27632</td><td>幹細胞テクノロジー</td><td>#72304</td><td>1 mM ストック</td></tr><tr><td>RT LTS 1000 ul ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>#30389218</td><td>&nbsp;オルガノイドの移管用</td></tr><tr><td>STEMdiff Cerebral Organoid Kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#08570</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 造血キット</td><td>StemCell Technologies</td><td>#5310</td><td>造血キット</td></tr><tr><td>StemPro Neural Supplement</td><td>Gibco</td><td>A1050801</td><td>Neural supplement</td></tr><tr><td>TGF-&beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Total RNA Purification Plus Kit</td><td>Norgen</td><td>#48400</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Visikol Histo-Starter Kit</td><td>Visikol</td><td>HSK-1</td><td>オルガノイド透明化液 HISTO-M、洗浄バッファー</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510-META 共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

Derivation of a Human Brain Organoid with Microglia Development

私たちのプロトコルは、HPCとiPS細胞を区別し、HPCとiPS細胞を混合してEBを作り、その後、神経誘導、分化、成熟を行うというスキームに従っています(図1)。HPCの分化の高品質は、EB形成とその後のオルガノイド分化の成功にとって重要です。段階希釈培養技術を使用して、HPCの分化を開始するための適切な数とサイズのiPS細胞コロニーを作製します(図2A)。通常、iPS細胞コロニーは、培地A(図2B)での培養終了時に大きな形態変化を受け、培地B(図2C)での3日後には、培養容器のすぐ上に浮かんでいるか、培養容器の底に付着している均質な丸い細胞として、HPCの分化がさらに見られます。HPCは、コロニー様細胞クラスターを形成するために拡張する可能性があります(図2D)。HPCは10...

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for ...

derivation-of-a-human-brain-organoid-with-microglia-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオは、人工多能性幹細胞からヒトの脳オルガノイドを生成する方法を示しています。これは、ニューロスフェアが神経外胚葉層を形成し、それが他の胚葉の形成を抑制する方法を示しています。ニューロスフェアは3Dゲルマトリックスに埋め込まれ、ニューロ上皮芽を形成します。オルガノイド培地とインキュベートすると、これらの神経上皮芽は特定の脳領域に分化し、成熟した脳オルガノイドが形成されます。...

ヒト脳オルガノイドを作製するためのIn Vitro法

神経上皮組織の前例のない複雑さのために、人間の脳の発達をモデル化することが妨げられてきました。ここでは、ヒトの脳発生の初期のイベントを明らかにし、in...

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

このプロトコルでは、発展途上の人間の脳のジカ ウイルス感染症をモデルに使用されるテクニックについて説明します。野生型または設計の幹細胞ラインを使用して、研究者は、様々 なメカニズムや初期の脳の感染症やジカ...

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカ ウイルス感染症をモデル化

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

本研究では、ヒトの神経オルガノイド内のヒト神経オルガノイド内のヒト神経膠芽腫の発達を研究するための関連的かつ正確なモデルとして、2つの特定のヒト神経オルガノイドを導出するプロトコルを紹介し、説明する。三次元オルガノイドを生成する分化。...

脳癌と神経変性疾患を研究するためのヒト神経オルガノイド

このプロトコルは、脳細胞の多様性と細胞組織の多くの特徴を維持しながら、外因性成長因子または基下膜マトリックスを用いることなく、単純化された低コストの方法で脳オルガノイドを生成する手段として生成された。...

ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法

このプロトコルは、生きている、大人、人間の脳組織から原発ミクログリアを単離する効率的で費用対効果が高く、堅牢な方法です。孤立した原発性ヒトミクログリアは、恒常性および疾患における細胞プロセスを研究するためのツールとして役立つ。...

成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。脳オルガノイドを大量に、高品質で得るために、自家製ミニバイオリアクターを使用しています。...

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

本研究では、標準的なフィーダーフリーhPSC培養を用いた、シンプルでありながら堅牢な皮質オルガノイド培養システムのための詳細な技術を提供する。これは、...

インビトロでの脳ニューロン老化のモデリングのための皮質脳オルガノイドの堅牢で再現性の高い生成

ミクログリアは、網膜に特異的に存在した免疫細胞であり、さまざまな網膜変性疾患において重要な役割を果たしています。網膜オルガノイドとミクログリアの共培養モデルを作成することで、網膜疾患の病因と発症の進行の理解を深めることができます。...

ミクログリアによる網膜オルガノイドの組み立て

学ぶヒト脳オルガノイドの作製法。iPSC由来造血前駆細胞を組み込み、ミクログリアと神経細胞を含む3Dモデルを構築し、脳発達における細胞間相互作用を研究する新たな神経科学研究ツールを提供します。

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

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