非遺伝的光刺激によるCa²⁺ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

この研究は、材料ベースの光刺激法を統合することにより、in vitro心臓微生物学的モデルを進歩させることを目的としています。これは、寿命と刺激侵襲性の限界を克服することに焦点を当て、心臓生理学の研究、薬物スクリーニングプロセスの改善、および疾患モデリングのアプリケーションの促進のための信頼性の高いツールを提供します。近年の生体刺激の進歩は、精密な非侵襲的細胞制御など、活用されています。

オプトジェネティクスは、遺伝子組み換えによる細胞活動の調節を可能にし、新興の材料ベースの光トランスデューサーは、非遺伝的な代替手段を提供します。このイノベーションは、さまざまなアプリケーションにわたるニューロン、心筋細胞、および骨格筋細胞の研究と調節において大きなブレークスルーをもたらします。現在の実験上の課題には、深部組織への一貫した光送達の達成、光トランスデューサーの生体適合性と安定性の最適化、光ベースの刺激技術の精度の向上などがあります。

さらに、これらの方法を複雑な生物学的システムと統合しながら、細胞の生存率と機能を維持することは、依然として重要なハードルです。このプロトコルは、心臓微生物学的モデルにおける非侵襲的で正確な刺激技術の必要性の研究ギャップに対処します。Ziapin2のような材料ベースの光トランスデューサーを使用することにより、このアプローチは従来の電気刺激と光遺伝学の限界を克服し、組織の生存率と機能を維持しながら、時間的および空間的な輪郭を強化します。

私の発見は、心臓組織の細胞活動をより正確に制御する非侵襲的な材料ベースの光刺激技術を導入することにより、研究を前進させます。このアプローチにより、遺伝子組み換えが不要になり、心機能のモデル化、疾患メカニズムの研究、より効果的な治療戦略の開発のための汎用性の高いツールが提供されます。まず、白と青の2層の実験用テープを、厚さ1mmの透明で傷がつきにくく、紫外線に強いアクリルシートに接着します。

意図したデザインに従ってテープのチップパターンをカットし、次に二酸化炭素レーザー彫刻機を使用して、アクリルシートを円にカットします。ピンセットを使用して、最も内側の線の内側にある2層のテープをはがします。チップを純粋な漂白剤に30分から1時間浸して、切断による太い線や黒い斑点を取り除き、鋭い線を残し、ビーカーで一晩または少なくとも3時間、脱イオン水を流してチップを洗い流します。

ポリジメチルシロキサンまたはPDMSスタンプでチップを10分間超音波処理し、ライン溝の特徴を付けたものをきれいな70%エタノールで30分間超音波処理します。チップとスタンプをフードの下のきれいな場所に移し、空気の流れで約1〜2時間乾燥させます。次に、調製したばかりのゼラチンを15分間超音波処理し、使用する準備ができるまで摂氏65度の水浴に戻します。

微生物トランスグルタミナーゼ(MTGチューブ)をキャップを少し緩めたデシケーターに入れ、真空機をゆっくりとオンにして気泡を取り除きます。脱気後、MTGチューブを摂氏37度のウォーターバスに戻します。次に、グリッドシートをきれいなパラフィルムで覆い、チップをグリッドに置きます。

PDMSスタンプは近くに置いておいてご使用ください。5ミリリットルのゼラチン溶液に5ミリリットルのMTGを加え、気泡を避けるために慎重にピペッティングします。次に、約0.5ミリリットルのゼラチン混合物を各チップにすばやく分注し、混合物がチップ領域をカバーしていることを確認します。

ラインパターンのPDMSスタンプを上に置き、200グラムの重りを適用して、ゼラチンが組織の縦軸と平行にパターン化されるようにします。すべてのチップが成形されたら、環境の乱れを避けるためにガラス瓶で覆い、一晩で架橋できるようにします。PBSを充填した新しいP150皿にチップとPDMSスタンプを挟み替えてゼラチンを30分から1時間水和させ、チップからPDMSスタンプを分離しやすくします。

チップの周りの余分な型外ゼラチンを取り除いた後、きれいなチップをPBSで満たされた新しいP150ディッシュに移します。PDMSスタンプを70%エタノールで保存します。チップを滅菌するには、ボンネットの下でエタノールに10分間浸します。

チップをPBSに移し、10分間浸した後、PBSを3回洗浄します。コーティング溶液については、1ミリリットルあたり20マイクログラムのフィブロネクチンを、サプリメントなしで培養培地で1〜100希釈のゲルトレックスと混合します。チップをこの溶液で摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターで2時間コーティングします。

10マイクロモルY-27632を含むRPMI培地で、ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞を解凍し、播種します。24時間後に培地をY-27632のないRPMIと交換してください。細胞播種から3日後、ピンセットを使用してチップから白いテープを慎重に取り除きます。

高速度カメラを搭載した改造タンデムレンズ顕微鏡と励起光源として200ミリワットの水銀ランプからなる光学マッピング装置を準備します。指定のカルシウムイメージングカメラの前にダイクロイックミラーを置きます。光ペーシングの場合は、LED光源を使用して組織の一端に光学点刺激を加え、光変換器であるZiapin2を刺激します。

組織から1ミリメートル離れた位置に配置された時間的に調整された光ファイバーを介して、0.5または1ヘルツの周波数で組織のペースを調整します。2マイクロモルのX-Rhod-1を培養培地に添加して、サンプルを37°Cで30分間インキュベートします。チップスを新鮮な培地で洗浄した後、B-27マイナスインスリンとHEPESを添加したフェノールレッドフリーRPMI 1640培地に移します。

生理学的温度に設定された温度制御された皿に組織チップを置き、毎秒2.5フレームのフレームレートで記録を開始します。カルシウム波の伝搬は、0.5ヘルツまたは1ヘルツの周波数での光刺激中の明確な空間的および時間的分解能で、生理学的値と一致する約4.5センチメートル/秒と計算された伝導速度で、うまく視覚化されました。振幅、立ち上がり時間、最大減衰、傾き、減衰時間などのカルシウム過渡パラメータは、光刺激と電気刺激の間で定量的に類似しており、同等の機能的応答が確認されました。