Name: ラット視神経への注射のための経結膜アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 33 s
Description: 学ぶラット視神経への経結膜アプローチによる注射法。神経線維腫症1型研究における治療薬送達を改善する低侵襲技術で、直接可視化下でアデノ関連ウイルスEGFPや染料を注入する方法です。

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<ol><li>Korn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+neuroprotective+effects+of+methylprednisolone+and+surgical+decompression+in+a+rodent+model+of+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the neuroprotective effects of methylprednisolone and surgical decompression in a rodent model of traumatic optic neuropathy.</a> Curr Eye Res. 47 (3), 461-467 (2022).</li>
<li>Lim, J. Y., Utzschneider, D. A., Sakatani, K., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+attenuation+of+GABA+sensitivity+in+the+maturing+myelin-deficient+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The attenuation of GABA sensitivity in the maturing myelin-deficient rat optic nerve.</a> Brain Res Dev Brain Res. 72 (1), 15-20 (1993).</li>
<li>Singh, D., Dromel, P. C., Perepelkina, T., Baranov, P., Young, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C6+cell+injection+into+the+optic+nerve+of+long-evans+rats%3A+A+short-term+model+of+optic+pathway+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">C6 cell injection into the optic nerve of long-evans rats: A short-term model of optic pathway gliomas.</a> Cell Transplant. 29, 963689720964383(2020).</li>
<li>Schwaner, S. A., Feola, A. J., Ethier, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+optic+nerve+head+biomechanics+in+a+rat+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Factors affecting optic nerve head biomechanics in a rat model of glaucoma.</a> J R Soc Interface. 17 (165), 20190695(2020).</li>
<li>Ellouze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+allotopic+expression+of+the+human+mitochondrial+ND4+prevents+blindness+in+a+rat+model+of+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Optimized allotopic expression of the human mitochondrial ND4 prevents blindness in a rat model of mitochondrial dysfunction.</a> Am J Hum Genet. 83 (3), 373-387 (2008).</li>
<li>Kwon, H., Park, M., Nepali, S., Lew, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-preconditioned+placenta-derived+mesenchymal+stem+cells+rescue+optic+nerve+axons+via+differential+roles+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+an+optic+nerve+compression+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-preconditioned placenta-derived mesenchymal stem cells rescue optic nerve axons via differential roles of vascular endothelial growth factor in an optic nerve compression animal model.</a> Mol Neurobiol. 57 (8), 3362-3375 (2020).</li>
<li>Pang, I. H., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+glaucoma+retinopathy+and+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy.</a> J Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).</li>
<li>Raykova, K., Jones, M. V., Huang, H., Hoffman, P. F., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally-invasive+Technique+for+Injection+into+Rat+Optic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve.</a> J Vis Exp. (99), e52249(2015).</li>
<li>Hallas, B. H., Wells, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+mulitple+injections+into+the+mamallian+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Kopf+Carrier%22%5BJournal%5D)">A novel technique for mulitple injections into the mamallian optic nerve.</a> Kopf Carrier. 54, 1-10 (2000).</li>
<li>Yan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+optic+nerve+transection+in+rats%3A+A+model+established+with+a+new+operative+approach+to+assess+secondary+degeneration+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Partial optic nerve transection in rats: A model established with a new operative approach to assess secondary degeneration of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (128), e56272(2017).</li>
<li>Han, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+progenitor+cell+grafts+in+immunocompromised+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of human induced pluripotent stem cell-derived retinal progenitor cell grafts in immunocompromised rats.</a> Cell Transplantation. 31, 1-25 (2022).</li>
<li>Tang, Y., Gutmann, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+Type+1-associated+optic+pathway+gliomas%3A+Current+challenges+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Manag+Res%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis Type 1-associated optic pathway gliomas: Current challenges and future prospects.</a> Cancer Manag Res. 15, 667-681 (2023).</li>
<li>Pan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+biomimetic+polydopamine+nanocomposite+scaffold+promotes+optic+nerve+regeneration+through+modulating+inhibitory+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Implantation of biomimetic polydopamine nanocomposite scaffold promotes optic nerve regeneration through modulating inhibitory microenvironment.</a> J Nanobiotechnol. 22 (1), 683(2024).</li>
<li>Gokoffski, K. K., Peng, M., Alas, B., Lam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-protection+and+neuro-regeneration+of+the+optic+nerve%3A+recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuro-protection and neuro-regeneration of the optic nerve: recent advances and future directions.</a> Curr Opin Neurol. 33 (1), 93-105 (2020).</li>
<li>Negishi, H., Dezawa, M., Oshitari, T., Adachi-Usami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+regeneration+within+artificial+Schwann+cell+graft+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Optic nerve regeneration within artificial Schwann cell graft in the adult rat.</a> Brain Res Bull. 55 (3), 409-419 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9542</td><td>1:10,000希釈、凍結切片の染色に使用</td></tr><tr><td>AAVウイルス粒子</td> ベ<td>クタービルダー</td><td>N/A</td><td>視神経注射に使用されるベクター</td></tr><tr><td>アクアマウント封入剤</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td>染色凍結切片のマウントに使用</td></tr> ウ<tr><td>シ血清アルブミン&NBSP;</td><td>Research Products International Corp</td><td>9048-46-8</td><td>凍結切片の染色プロセスで使用ヤ</td></tr><tr><td>ギ抗ラット Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A-11006</td><td>1:1000 希釈液、凍結切片の染色に使用</td></tr><tr><td>イソフロランガス</td><td>プライマルヘルスケア</td><td>66794-017-10</td><td>麻酔用ガス</td></tr><tr><td>ライカ TCS SPE 正立共焦点顕微鏡システム&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステム</td>ズ <td>N/A</td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ</td><td>BD</td><td>309628</td><td>注射用シリンジ</td></tr><tr><td>Microm HM505E クライオスタット&nbsp;</td><td>マイクロム</td><td>M-HM360 フォー マーシャル サイエンティフィ</td>ック 標<td>本切片化に使用されます</td></tr> ラ<tr><td>ット抗 GFP&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>338002</td><td>1:500 希釈液、凍結切片の染色に使用</td></tr><tr><td>脊髄フック</td><td>FST</td><td>10162-12</td><td>視神経を分離するために使用されるフック</td></tr><tr><td>10 マイクロリットルの注射器</td><td>ハミルトン</td><td>CAL 803901</td><td>注射用注射器</td></tr><tr><td>33 ゲージ</td>針 <td>JBP</td><td>JBP3308B</td><td>注射用針</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT コンパウンド&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td>クライオモールド処理に使用</td></tr><tr><td>歯付き鉗子</td><td>Bausch and Lomb</td><td>E1809</td><td>結膜をつかむための鉗子</td></tr><tr><td>Westcott 湾曲腱切開はさみ</td><td>Bausch and Lomb</td><td>E3323-R</td><td>はさみで腹膜切開を作成します</td></tr></tbody></table>

ラット視神経への注射のための経結膜アプローチ

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

この手法を用いたラット視神経注射の代表的な実験結果を 図2に示します。この例では、アデノ随伴ウイルス-eGFP(AAV-eGFP)を、10μLシリンジに接続された33G針を用いて、上述の経結膜技術を用いてラット視神経に注入した。これらの結果は、神経線維腫症1(NF1)のラットモデルにおいて、AAVを使用して視神経にCRISPR補正を届けるという究極の目的の一部として、この技術を使用して視神経注射を研究する実験の一部でした。色素とAAVベクターの組み合わせを使用して、注入技術を開発しました。動物は視神経への注射の7日後に犠牲にされました。次に、神経を解剖し、抗GFP抗体で標識して、共焦点顕微鏡で視神経をイメージングできるようにし、材料が視神経鞘をうまく貫通して視神経に入ったことを確認しました。視神経への物質の正常な導入は、抗体染色によって確認され、 図2Aに示すように、共焦点顕微鏡では緑色に見えました。視神経鞘の貫通が完全でない場合、または針跡から物質が流出した場合、 図2Cに示すように、神経組織内ではなく視神経鞘の縁に沿って染色が見られました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68048/68048fig01.jpg"> 
図1:手術手順の順序 (A)結膜を歯付き鉗子でつかみ、ウェストコットハサミを使用して辺縁部腹膜を造成する。(B)ほぞの筋膜が開いて鈍く解剖された後、ウェストコットのハサミの助けを借りて軌道が露出します。(C)脊髄フックを挿入し、視神経を分離するために使用されます。(D)上にある眼窩組織の鈍的解剖後、脊髄フックを使用して視神経を露出させます。(E)33Gの針を使用して視神経鞘を貫通し、アデノウイルスまたは色素を視神経に注入します。(F)地球を軌道に再配置し、結膜をペリトミー部位の上に再配置します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68048/68048fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68048/68048fig02.jpg"> 
図2: AAV-eGFP(緑)の注射成功から7日後のラット視神経の代表的な蛍光共焦点パノラマ画像で、視交叉付近のニューロンがベクトル変換されました。(A)視神経核はDAPI(青)でラベル付けされています。矢印の付いたONHは視神経頭または神経の眼窩端を示し、視交叉端は「交叉」とラベル付けされます。(B)凍結凍結切片ブロックに埋め込まれた眼窩から視交叉までのラット視神経の写真。神経には、視神経の向きを変えるために、眼窩のすぐ後方(黒い矢印で示された注射部位)にインディアインクが注入されます。(C)AAV-eGFPの注射失敗から7日後のラット視神経のパノラマ蛍光画像(緑)では、ほとんどのベクター懸濁液が神経管から流出し、視鞘を形質化した可能性が高い。視神経核はDAPI(青)でラベル付けされています。ONHは、神経網膜のすぐ後方にある視神経頭と、白い矢印で示された注射部位を示します。視交叉と白い矢印は視交叉に向かって境界を定めています。スケールバー = (A) で 400 μm、(C) で 200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68048/68048fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>変数</td>
			<td colspan="3">接近</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>経結膜</td>
			<td>目上</td>
			<td>側面</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>皮膚切開</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>結膜切開</td>
			<td>はい</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>顕微鏡</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>上眼窩筋の切断</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
			<td>いいえ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牽引縫合糸</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脊髄フック</td>
			<td>はい</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>皮膚縫合糸</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:実験的研究のためにラット視神経を分離するための以前に発表された技術との比較。 皮膚切開、結膜切開、手術顕微鏡、上眼窩筋の切断、牽引縫合、脊髄フック、皮膚縫合の必要性などの変数は、経結膜、上、および横方向のアプローチを使用して比較されます。

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

transconjunctival-approach-for-injection-into-the-rat-optic-nerve

Research

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