Name: 大規模DNAテンプレートの相同性を介した末端結合標的統合 による 初代ヒトT細胞の非ウイルス工学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9を用いた非ウイルス的初代ヒトT細胞工学プロトコル。相同性媒介末端結合経路で大規模DNAテンプレートを標的統合し、免疫療法用に機能を保持したCAR-T細胞を効率的に作製する方法です。

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<ol><li>Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">T cells in health and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature reviews. Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li>
<li>Dotti, G., Gottschalk, S., Savoldo, B., Brenner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+therapies+using+chimeric+antigen+receptor-expressing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells.</a> Immunol Rev. 257 (1), 107-126 (2014).</li>
<li>DeRenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+strategies+to+enhance+CAR+T+cell+persistence+for+patients+with+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors.</a> Front Immunol. 10, 218(2019).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chimeric+switch-receptor+targeting+PD1+augments+the+efficacy+of+second-generation+CAR+T+cells+in+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A chimeric switch-receptor targeting PD1 augments the efficacy of second-generation CAR T cells in advanced solid tumors.</a> Cancer Res. 76 (6), 1578-1590 (2016).</li>
<li>Yeku, O. O., Purdon, T. J., Koneru, M., Spriggs, D., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Armored+CAR+T+cells+enhance+anti-tumor+efficacy+and+overcome+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Armored CAR T cells enhance anti-tumor efficacy and overcome the tumor microenvironment.</a> Sci Rep. 7 (1), 10541(2017).</li>
<li>Schober, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+replacement+of+T-cell+receptor+%CE%B1-+and+%CE%B2-chains+with+preservation+of+near-physiological+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Orthotopic replacement of T-cell receptor α- and β-chains with preservation of near-physiological T-cell function.</a> Nat Biomed Eng. 3 (12), 974-984 (2019).</li>
<li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+T+cell+function+and+specificity+with+non-viral+genome+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.</a> Nature. 559 (7714), 405-409 (2018).</li>
<li>Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-based+cancer+immunotherapy%3A+Emerging+efficacy+and+pathways+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance.</a> Immunol Rev. 290 (1), 127-147 (2019).</li>
<li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenberg%2C+SA+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+antigen+and+NK+cell+activating+ligand+expression+in+malignant+cells%3A+a+story+of+loss+or+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">HLA antigen and NK cell activating ligand expression in malignant cells: a story of loss or acquisition.</a> Semin Immunopathol. 33 (4), 321-334 (2011).</li>
<li>Walther, W., Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+transfer%3A+a+review+of+their+use+in+the+treatment+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases.</a> Drugs. 60 (2), 249-271 (2000).</li>
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<li>Kumar, M., Keller, B., Makalou, N., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+determination+of+the+packaging+limit+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors.</a> Hum Gene Ther. 12 (15), 1893-1905 (2001).</li>
<li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature reviews. Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Pomeroy, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+genetically+engineered+primary+human+natural+killer+cell+platform+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">a genetically engineered primary human natural killer cell platform for cancer immunotherapy.</a> Mol Ther. 28 (1), 52-63 (2020).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Sci Rep. 8 (1), 12144(2018).</li>
<li>Nguyen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stabilized+Cas9+nanoparticles+and+modified+repair+templates+increase+genome+editing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.</a> Nat Biotechnol. 38 (1), 44-49 (2020).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Semenova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cytosolic+DNA+sensors+bind+plasmid+DNA+after+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple cytosolic DNA sensors bind plasmid DNA after transfection.</a> Nucleic Acids Res. 47 (19), 10235-10246 (2019).</li>
<li>Wimberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+inhibition+of+DNA-PK+and+Pol%CF%B4+improves+integration+efficiency+and+precision+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Simultaneous inhibition of DNA-PK and Polϴ improves integration efficiency and precision of genome editing.</a> Nat Comm. 14 (1), 4761(2023).</li>
<li>Monjezi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CAR+T-cell+engineering+using+non-viral+Sleeping+Beauty+transposition+from+minicircle+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors.</a> Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).</li>
<li>Kay, M. A., He, C. -Y., Chen, Z. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nat Biotechnol. 28 (12), 1287-1289 (2010).</li>
<li>Webber, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-induced+targeted+integration+of+large+DNA+payloads+in+primary+human+T+cells+via+homology-mediated+end-joining+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cas9-induced targeted integration of large DNA payloads in primary human T cells via homology-mediated end-joining DNA repair.</a> Nat Biomed Eng. 8, 1553-1570 (2024).</li>
<li>Williams, J. A., Paez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell+and+gene+therapy+safety+and+performance+using+next-generation+Nanoplasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Improving cell and gene therapy safety and performance using next-generation Nanoplasmid vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 494-503 (2023).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> eLife. 9, 53968(2020).</li>
<li>Hendel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified+guide+RNAs+enhance+CRISPR-Cas+genome+editing+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present%2C+and+future+of+non-viral+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The past, present, and future of non-viral CAR T cells.</a> Front Immunol. 13, 867013(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>ミリポア シグマ</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>2.5% CTS 免疫細胞血清置換</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa P3 初代細胞 4D 核因子 X キット L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa P3 初代細胞 4D 核因子 X キット S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>化学修飾ガイド RNA</td><td>統合 DNA テクノロジー</td><td>na</td><td>カスタムデザイン</td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink</td><td>L-7206</td><td></td></tr><tr><td>CTS OpTmizer T 細胞増殖培地 SFM +OpTmizer T 細胞増殖サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A1048501</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>幹細胞技術</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ヒト T 活性化因子 CD3/CD28&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>11141D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ヒトIL15</td>ペ<td>プロテック</td><td>200-15</td><td></td></tr>ヒ<tr><td>トIL2</td>ペ<td>プロテック</td><td>200-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ヒト IL7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモ サイエンティフィック&nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>ロンザ 4D 核膜&nbsp;コア</td><td>ロンザ</td><td>AAF-1003B</td><td></td></tr><tr><td>ロンザ4D核実験器&nbsp;X ユニット</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>Minicircle</td><td>System Biosciences</td><td>MN910A-1</td><td>カスタムデザイン</td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>ナノプラスミド</td><td>アルデブロン</td><td>ナ</td><td>カスタムデザイン</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15-140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

大規模dnaテンプレートの相同性を介した末端結合標的統合 による 初代ヒトt細胞の非ウイルス工学

Non-Viral Engineering of Primary Human T Cells via Homology-Mediated End-Joining Targeted Integration of Large DNA Templates

ここでは、「Giant Minicircle」コンストラクトと呼ばれる大きな(&gt;6.3 kb)マルチシストロニックテンプレートを、CRISPR/Cas9編集を使用して初代ヒトT細胞の TRAC 遺伝子座に統合しました。TRAC特異的gRNA(TCTCTCAGCTGGTACACGGC)、UgRNA、およびHMEJナノプラスミド(図2A)で、 TRAC特異的gRNA、ユニバーサルgRNA、およびCas9 mRNAをネガティブコントロールとして使用した状態。Giant Minicircleコンストラクト、 TRAC特異的gRNA、ユニバーサルgRNA、Cas9 mRNAを含むサンプルは、GFP発現の測定時の平均ノックイン率が23.35%(23.5%±5.247)でしたが、ネガティブコントロールではGFP発現は見られませんでした(図2B)。実験条件間で倍率拡大(図2C)と生存率(図2D)に有意差はありませんでした。これらの結果は、非常に大きなテンプレートの高効率ノックインが、優れた細胞生存率と細胞増殖を維持しながら実証されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68150/68150fig01.jpg"> 図1:HMEJコンストラクト設計の概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68150/68150fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68150/68150fig02.jpg"> 図2:巨大なミニサークルコンストラクトでエレクトロポレーションしたT細胞の特性評価。 (A)ジャイアントミニサークルコンストラクトの概略図、GSGリンカー、抗CD19 CAR、およびMNDプロモーターの下でDHFRミューテインとeGFPを備えたTRACプロモーターの下で抗メソセリンCARおよびRQR8をコードする大きな(&gt;6.3 kb)マルチシストロニックテンプレート。(B)エレクトロポレーションの9日後にGiant MinicircleコンストラクトとCRISPR-Cas9試薬を使用したT細胞のRQR8発現率、(C)倍増拡大、および(D)生存率を、CRISPR-Cas9試薬を含まないGiant Minicircleでエレクトロポレーションしたネガティブコントロールと比較しました。(***p &lt; 0.001)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68150/68150fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>プレートサイズ</td>
			<td>キュベット容量</td>
			<td>細胞/ウェル</td>
			<td>リカバリメディアの容量</td>
			<td>NAC付き1x TCMのボリューム</td>
			<td>合計最終ボリューム</td>
		</tr><tr><td>24ウェルプレート</td>
			<td>22/22 μL</td>
			<td>1-3×106</td>
			<td>300μL</td>
			<td>680μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>6ウェルプレート</td>
			<td>100/110 μL</td>
			<td>4-20×106</td>
			<td>1 mLの</td>
			<td>2.9ミリリットル</td>
			<td>4ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>24ウェルG-Rexプレート</td>
			<td>20-110μL</td>
			<td>1-20×106</td>
			<td>400μL</td>
			<td>5.6ミリリットル</td>
			<td>6ミリリットル</td>
		</tr></tbody></table>表1:キュベットとリカバリープレートの細胞濃度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>キュベットサイズ</td>
			<td>テンプレートプラスミド</td>
			<td>標的部位のgRNA</td>
			<td>プラスミド直鎖化gRNA</td>
			<td>Cas9 mRNA</td>
		</tr><tr><td>20μL</td>
			<td>1-2 μg (1 μg)</td>
			<td>1-3 μg (1 μg)</td>
			<td>1-3 μg (1 μg)</td>
			<td>1-3 μg (1.5 μg)</td>
		</tr><tr><td>100μL</td>
			<td>5-10 μg (5 μg)</td>
			<td>5-15 μg (5 μg)</td>
			<td>5-15 μg (5 μg)</td>
			<td>5-15 μg (5 μg)</td>
		</tr></tbody></table>表2:必要なCRISPR/Cas9試薬とDNAテンプレートの量。

大規模DNAテンプレートの相同性を介した末端結合標的統合 による 初代ヒトT細胞の非ウイルス工学

Many current adoptive cellular therapies rely on lenti- or retroviral vectors to engineer T cells for the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) ...

non-viral-engineering-primary-human-t-cells-via-homology-mediated-end

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

の世代のための迅速、簡単かつコスト効率の良いプロトコルドナー由来のCMV、前売またはEBV感染症を発症する危険性がある同種造血幹細胞移植（HSCT）の受信者に注入するためmultivirus特異的CTL（rctlを）。この製造プロセスはGMPに準拠しており、専門センターを超えてT細胞免疫療法の広範な実施を確保すべきである。...

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

遺伝子ターゲティング方法論は、ノックアウト、ノックイン、タグ付き対立遺伝子を持つトランスジェニックマウスを生成するために使用することができます。...

サブクローニングプラス挿入（SPI） - ジーンターゲティングベクターの迅速な構築のための新しい遺伝子改変方法

このプロトコルは、転写因子の強制発現を通じて、ヒト多能性幹細胞からの血行性内皮および多能性造血前駆細胞の効率的な誘導について説明しています。...

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。...

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体（TCR）を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。...

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

この原稿では、上流および下流のベクター - 宿主接合DNAを同時に解析できる双方向インテグレーションサイトアッセイの実験手順とソフトウェア解析について説明します。双方向PCR産物は、任意の下流の配列決定プラットフォームに使用することができる。得られたデータは、統合されたDNA標的の高スループット、定量的比較に有用である。...

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

このプロトコルは、世代のためと麻疹ウイルスの例として二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコードを使用して免疫の発現は、腫瘍溶解性ウイルスの体内における性状 ex 詳細なワークフローを説明します。アプリケーションと他のベクトルのプラットフォームや遺伝子への適応は、臨床的翻訳の新規 immunovirotherapeutics...

腫瘍標的免疫のパラミクソ ウイルス: 設計と評価 Ex Vivo

ここでは、遺伝子ノックアウト(KO)およびノックイン(KI)のプライマリヒトB細胞のCRISPR/Cas9ベースのゲノム工学に関する詳細なステップバイステッププロトコルを提供し、B細胞における遺伝子の生物学的機能とB細胞治療薬の開発を研究します。...

CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

造血幹細胞生物学および造血悪性腫瘍をよりよく研究するためには、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の体細胞変異を忠実にモデル化するための新しい戦略が必要です。ここでは、CRISPR/Cas9とデュアルrAAVドナー形質導入の使用を組み合わせることにより、HSPCにおけるヘテロ接合機能獲得変異をモデル化するためのプロトコルについて説明します。...

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

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