Ovoに位置 患者由来急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の異種移植 (PDX-ALL)

この研究の範囲はがん生物学であり、がんを治療するための治療戦略を特定することに重点を置いています。卵内患者由来異種移植片急性リンパ芽球性白血病モデルは、約 10 日間という比較的短い実験期間によって制約されており、この期間を超えた急性リンパ芽球性白血病の進行または薬物反応に関する長期研究が制限されています。このプロトコルは、B 細胞および T 細胞系統を含む患者由来の急性リンパ芽球性白血病細胞の卵内異種移植のための迅速かつ費用対効果の高い方法を確立します。

このプロトコルは、白血病研究における前臨床薬物スクリーニング、機構研究、および潜在的に個別化医療アプローチのための有望なツールを表しています。前臨床応用に確立された卵内異種移植モデルを使用する実現可能性が調査されます。まず、調達した卵を湿度約50〜60%、温度39°Cに設定した加湿ローリングインキュベーターに移します。

受精後10日間、このインキュベーターで卵を孵化させます。血液サンプルを滅菌の50ミリリットル遠心分離管に移し、2容量のPBSを使用して各サンプルを3回希釈します。サンプルを密度勾配培地とともに遠心分離した後、界面から単核細胞のバフィーコート層を収集し、新しい滅菌15ミリリットルチューブに移します。

10ミリリットルのPBSをチューブに加え、チューブを300 Gで5分間遠心分離して、残りの血清成分を除去します。ペレット化された細胞を10%FBSを添加したRPMI 1640培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞数を数えます。

FBS中の10%DMSOからなる凍結培地に細胞を再懸濁します。トリパンブルー排除アッセイを使用して細胞生存率を評価し、細胞を摂氏マイナス80度で凍結し、液体窒素に保存します。次に、Lipofectamine 3000を使用して150万HEK 293 T細胞を目的のプラスミドベクターで共トランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を2日間インキュベートします。

レンチウイルスを含む上清をウェルから採取し、0.45マイクロメートルのフィルターでろ過して破片を除去します。ろ過したウイルス上清を遠心分離管に移し、摂氏4度で20, 000 Gで2時間遠心分離します。標識のために、B細胞前駆体SEMおよびT細胞MOLT3細胞株、および患者由来のBまたはT急性リンパ芽球性白血病細胞の1ミリリットルあたり100万個の細胞を、10%FBSを含むRPMI 1640を含む6ウェルプレートにプレートします。

mCherry標識細胞を蛍光顕微鏡で可視化します。10日目に、ニワシ胚の血管系を光の下で調べて胚の生存率を評価し、各卵の表面を70%エタノールで優しく洗浄します。ハンドドリルを使用して、各卵のエアセルにドリルで穴を開け、直径約2センチメートルの小さな窓を作成します。

作成した窓を透明な粘着テープで密封し、卵を5%二酸化炭素のインキュベーターに戻します。11日目に、34ゲージの針を使用して、1,000万mCherry標識の急性リンパ芽球性白血病細胞を発育中の胚の血管に注入します。窓を密閉した後、卵子を5%二酸化炭素のインキュベーターに戻し、胚の生存率を毎日監視します。

15日目に、胚から血管を解剖します。それらをスライドガラスの上に置き、蛍光機能を備えた解剖顕微鏡を使用して成功した異種移植片を撮影します。32ゲージの針が付いた滅菌注射器を使用して、鶏胚の血管系から血液を採取します。

血液をヘパリンを含む1.5ミリリットルの滅菌チューブに移し、摂氏4度で226Gで10分間遠心分離します。B細胞急性リンパ芽球性白血病細胞をヒトFITC CD10およびヒトPE CD19抗体で標識し、T細胞急性リンパ芽球性白血病細胞をヒトFITC CD4およびヒトPE CD8抗体でヒトFITC CD4およびヒトPE CD8抗体で暗闇で30分間標識します。標識細胞を1%BSAを含むPBSを用いて2回洗浄し、フローサイトメトリーを用いて分析する注射の4日後にSEMおよびMOLT3細胞株による血管のコロニー形成がはっきりと見られ、発育中のニワトリ胚血管系への生着が成功したことが確認された。

患者由来のB-all細胞とT-all細胞は、注射後4日で血管に強い蛍光シグナルを示し、血管系における活発なコロニー形成と増殖を示しました。フローサイトメトリーにより、注射の6時間後に採取された対照と比較して、SEMを注入した胚および患者由来のB-all細胞で、注射後4日でCD10/CD19陽性細胞の有意な増加が明らかになりました。同様に、CD4/CD8陽性細胞は、MOLT3を注入した胚および患者由来のT-all細胞で、注射後4日で有意に高かった。