背根神経節培養の In Vitro モデルの確立:がん-神経クロストーク研究のための補完的アプローチ

私たちの研究は、3D 後根神経節または DRG 外植片と 2D 解離培養物を使用して、神経誘導腫瘍遊走を定量化し、それらの相互作用を制限するための分子戦略をテストする、がん神経クロストークに焦点を当てています。このプロトコルにより、相補的な3Dおよび2D DRG培養を確立し、神経突起の成長を最適化し、神経突起の伸長に沿ったがん細胞の浸潤の増加を実証しました。1匹のマウスから相補的な2Dおよび3D DRG培養を作成することで、複雑な細胞レベルの相互作用と無傷の神経構造の両方を捉える再現性のあるモデルの欠如に対処しました。

私たちのプロトコルは、1匹のマウスからペアの3D外植片と2Dニューロン培養物を生成し、角度のあるテクスチャを維持し、ハイコンテントイメージングを可能にし、動物の使用を減らし、1回の実験で組織レベルおよび単一細胞データを取得できるようにします。私たちのモデルは、DRGが作成した因子が浸潤を引き起こすもの、ニューロンの活動、年齢、遺伝子型が浸潤をどのように形成するか、神経栄養因子受容体を標的とすることで神経突起誘導がんの広がりを減少させることができるかどうかについて疑問が生じました。まず、安楽死させたマウスを腹部に置きます。

背側表面を露出させるために脊柱の上の領域に焦点を当てて、毛皮を剃ります。動物の背中に70%エタノールをスプレーします。ペーパータオルを使用して尾から頭蓋骨まで拭き、緩んだ毛皮を取り除き、解剖中の汚染を防ぎます。

滅菌したハサミで、尾から頭蓋骨までの背側正中線に沿ってまっすぐな切開を行います。鈍い鉗子を使用して、切開部の両側の皮膚を引っ込めて脊柱を露出させます。次に、汚染を避けるために新しいハサミと鉗子を使用し、脊柱の末端に水平切開を行います。

次に、脊柱の両側に2つの平行な縦方向の切開を行い、脊柱を解放します。鉗子を使用して脊柱をそっと持ち上げ、周囲の結合組織を取り除きます。脊柱を完全に解放するには、頭蓋骨近くの脊柱の上部を切開します。

ペニシリンストレプトマイシンを氷上に保たれたHBSSを含む事前に冷却された10センチメートルのプレートに脊柱を移します。次に、バネハサミを使用して脊柱から残っている結合組織を取り除き、椎骨を露出させます。トリミングした脊柱を顕微鏡ステージに移します。

バネハサミを使用して矢状面に沿って柱を慎重に分割します。先端の細い鉗子を使用して、脊柱から脊髄を取り除き、脊髄神経の根に沿って後根神経節を明らかにします。スプリングハサミを使用して脊髄神経を切断します。

次に、後根神経節から周囲の結合組織をすべて除去します。先端の細い鉗子を使用して、後根から後根神経節をそっと抽出します。ホールマウント培養の場合、氷上にペニシリンストレプトマイシンを保持したHBSSを含む3センチメートルのプレートにDRGを置きます。

事前に冷却されたピペットチップを使用して、氷上の10センチメートルのプレート内に配置された8ウェルガラス底スライドの各ウェルに2マイクロリットルの冷却マトリゲルを分注します。早期重合を防ぐため、一度に1液滴のみピペットでピペットを打つ。次に、先端の細い鉗子を使用して、1つの後根神経節を乾いたプレートに置きます。

穏やかに旋回させて、余分なHBSSを取り除きます。次に、きれいな後根神経節をマトリゲル液滴に移します。すべての神経節を液滴に移した後、ガラス底スライドを摂氏37度の加湿インキュベーターで5分間インキュベートし、マトリゲルを重合させます。

次に、200マイクロリットルの温かい補充培地を各ウェルに注意深く加えます。スライドを摂氏37度で5%二酸化炭素とともにインキュベートします。明視野顕微鏡を使用して、後根神経節のニューロンの成長と生存率を毎日監視します。

プールされた後根神経節を含む15ミリリットルの円錐形チューブを200Gで室温で5分間遠心分離します。HBSSをピペッティングした後、予め温めた補給培地で神経節をすすぎ、軽くたたきます。次に、チューブを200Gで5分間遠心分離して、DRGをペレット化します。

培地を1ミリリットルのパパイン溶液と交換します。穏やかに混合し、組織培養インキュベーターで摂氏37度で20分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに攪拌します。次に、パパインを中和するために10ミリリットルの補給培地を加え、穏やかに混合します。

400Gで5分間遠心分離して、後根神経節をペレット化します。上清をピペッティングした後、1ミリリットルのコラゲナーゼIV型をディスパーゼII溶液に加え、再度インキュベートします。4.5ミリリットルの添加培地を加えて酵素溶液を中和し、穏やかに混合して遠心分離します。

上清をピペッティングした後、5ミリリットルの添加培地を加えます。次に、Dnase I を加えて、最終濃度 0.2 ミリリットルあたり 0.2 ミリグラムに達します。後根神経節は緩い塊として現れ、完全な消化を示します。

機械的解離のために、1, 000マイクロリットルのフィルターピペットチップを使用して、4〜5回上下にピペッティングすることにより、神経節溶液を粉砕します。200マイクロリットルのピペットチップに切り替え、4〜5回ピペッティングして粉砕を繰り返します。得られた濁った懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルの円錐形のチューブにろ過します。

次に、ストレーナーを10ミリリットルの培地で徐々にすすぎ、細胞が完全に移動できるようにします。ろ過した細胞懸濁液を1, 000Gで5分間遠心分離して、細胞をペレット化します。ペレットから培地を取り出し、細胞ペレットを500マイクロリットルの補充培地に再懸濁します。

8ウェルガラス底スライドのウェルから残留PBSをすべて除去します。解離した後根神経節懸濁液をコラーゲンでコーティングされたウェルに分配し、インキュベートします。明視野顕微鏡を使用して、後根神経節由来細胞を毎日監視し、細胞の生存率と神経成長を評価します。マウス神経節全体をがん細胞と共培養するには、まず、8ウェルガラス底スライド上のホールマウントDRG培養物から培地を吸引します。

ピペットを使用して、200マイクロリットルのがん細胞懸濁液をマトリゲル液滴と後根神経節を含むウェルにそっと加えます。共培養スライドを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%二酸化炭素とともにインキュベートします。200マイクロリットルの温めた補充培地で1回洗浄し、300マイクロリットルの新鮮な培地を追加して、培地を毎日リフレッシュします。

解離した神経節とがん細胞の共培養では、8ウェルガラス底スライド上の解離したDRG培養物から培地を吸引します。次に、インキュベーション前に200マイクロリットルのがん細胞懸濁液を各ウェルに穏やかに分配します。DRG の確立は、サプリメントがない場合効率が低く、神経突起の伸展が著しく減少しました。

高齢の動物からのホールマウントDRGは、神経突起の伸長が少なく、より区別しやすく、グリア細胞が最小限に生成され、神経がん細胞の相互作用の視覚化が容易になりました。2つの酵素ステップを使用したDRGニューロンの解離は、より高いニューロン回復をもたらしました。培養後24時間以内に、シュワン細胞、マクロファージ、線維芽細胞などの非神経細胞が明らかになり、DRG由来細胞から神経突起が発芽し、72時間後にさらに増加しました。

マトリゲルでコーティングされたトランスウェルインサートに播種されたがん細胞は、24時間のインキュベーション後にHEC293細胞に侵入しましたが、DRGニューロンには浸潤しませんでした。マトリゲル液滴に浸したホールマウントDRG培養物は、神経突起がマトリックスを通って外側に向かって外側に伸びることを可能にしました。DRGを液滴の中央に慎重に配置することで、境界を大きくすることなく神経突起を最大限に伸ばすことができます。

がん細胞は、DRGを含むマトリゲル液滴の境界の周りで12時間の共培養後に定着しました。72時間の共培養後、がん細胞はマトリゲルに侵入して神経節に向かって移動し、後根神経節細胞の伸長とがん細胞との直接的な相互作用が観察されました。解離したDRG由来細胞とがん細胞を共培養することで、個々の細胞相互作用を詳細に可視化することができました。