発達段階を超えてカスタマイズ可能な拡張可能な脳マトリックスの製作

ケンタッキー大学レキシントン校のチャップマンらによる、発達段階を超えてカスタマイズ可能な拡張可能な脳マトリックスの製作。子豚の脳の発達は、いくつかの点で人間の脳と非常に似ています。ラットやマウスと比べて、子豚の出生から成熟までの脳の重量比率は人間とかなり近く、子豚と人間の脳回および頭脳の機能領域は非常に似ています。

これらの理由から、神経科学研究における豚やその他の大型哺乳類の使用は増加しています。しかし、大型哺乳類向けの市販の脳マトリックスは高価であり、選択肢はしばしば単一のサイズや平面に限られています。そのため、市販のマトリックスは、雄雌両方、年齢ごとに異なる株に適しているとは限りません。

これは特に発達神経科学の研究において問題であり、出生後の成長に伴い脳の大きさが著しく変化します。例えば、子豚の脳は最初の3か月で急速に成長し、体積は3倍以上に増加します。市販の子豚脳マトリックスは、生後2週間までの子豚の脳を適合させるよう設計されています。

ここでは、コスト効率が高く実装しやすいアクリル板ベースのカスタマイズ可能なマトリックス構築法を紹介します。この実験のために、生後4日の無知な豚4頭が採取されました。1つは生後5日で脳採取に、2つは生後32日、1つは生後38日で使用されました。

脳を頭蓋骨から取り出した後、脳は10%緩衝ホルマリンに2日間浸けられ、その後30%ショ糖溶液に5日間冷凍保存されました。次に、アガロースジェルを使って脳のキャストを作る方法を紹介します。マトリックスを作る最初のステップは、脳の型を作ることです。

産後5日目の子豚脳の型を作る過程を示し、それを使って矢状マトリックスを構築します。ガラス容器の底に厚手のプラスチックの帯を置き、両端を容器の縁から外に出しておきましょう。このストリップはアガロースブロックの抽出を容易にします。

容器の半分ほどを湿った氷の入ったバケツに浸します。ガラス製のビーカーで、PBS150ミリリットルを90度まで加熱し、アガロース6グラムを加え、絶えずかき混ぜます。4%アガロース溶液をゆっくり注ぎ、容器の底に厚さの半センチから1センチの層を作り、固まらせます。

脳全体を薄いミネラルオイルの層で覆い、アガロースが脳表面に結合したり溝に閉じ込められたりするのを防ぎます。また、オイルのおかげでアガロースジェルから脳を除去するのもずっと管理しやすくなります。コーティングが完了したら、脳を冠状または矢状型の望ましい向きで薄いアガロースの層の上にできるだけまっすぐかつ直立させます。

アガロース溶液を50度まで冷やしながら、注ぎやすい粘度を保つために絶えずかき混ぜます。その後、アガロース溶液を脳にかけて完全に埋め込むまで注ぎます。アガロースを室温で固まらせます。

脳の輪郭に沿って外科プローブで脳の上部のアガロース層を切断します。脳の周りを切り終えたら、細いヘラでアガロースの上層を優しく剥がします。これらの工程では脳を切ったり傷つけたりしないように注意してください。

優しく脳全体を型から取り出します。先ほど表面に塗ったミネラルオイルのおかげで比較的簡単に落とせるはずです。アガロースジェルの小さな破片が印形に落ちているかは忘れずに取り除いてください。

ビーカーでPBS98ミリリットルを9度まで加熱し、アガロース4グラムとインディアインク2ミリリットルを加えます。よくかき混ぜて。この黒いアガロース溶液を脳の印象に注ぎ、印象があふれないように注意します。

黒いジェルが固まるのを待ちます。プラスチックストリップの両端を握り、アガロースブロック全体を容器から持ち上げます。これから、マトリックスのテンプレートプレートの作成方法を説明します。

脳型を切り取るには、76ミリの透明なアクリル板2枚の間にスケール紙を1枚置き、テーブルの端近くに置きます。次にクランプを使って4つの角の正方形と2枚のアクリル板を固定し、アガロースブロックを望む向きにぴったり固定する2つの壁を作ります。2枚の金属製コーナースクエアと2枚の縦のアクリルプレートの前縁は、スケール紙の片側に沿って整列させる必要があります。

アガロースジェルブロックを、切るエッジがスケール紙に沿って、また縦のアクリル板や角の四角の端と合うように置き、反対側に重りを置いて固定します。インディアのインク脳型が切り落とされるまで、余分な部分はブロックから切り落としましょう。アガロースブロックを、例えば2ミリメートルや5ミリメートルの望むステップで前に動かし、下地のスケール紙のマーキングの助けを借りて行います。

両手で刃をしっかり握り、アクリル板と角の四角い部分の前縁に沿って滑らせてブロックを切ります。それぞれのスライスを2枚目のスケール紙に置き、しっかりと押さえて印刷を紙に伝えます。ペンでスライス全体を輪郭を描きます。

スライスを外し、インクで識別される脳の輪郭を描きます。スケール紙の最初のスライスの向き、例えば矢状切面の場合は後方と前方に注意し、追加のゲルスライスを紙に加える際も一貫性を保ちましょう。それぞれに番号を付けて、順番にトレースします。

アクリル板を10×8 1/2センチにカットします。それらを積み重ね、角の角とクランプでドリルプレスのステージに固定します。原稿に示された座標でスタックに3つの穴を開けます。

アクリルプレートから保護フィルムを剥がしてください。次に、アクリル版を目張り紙のテンプレートの上に置き、アクリル版の線の上部をテンプレートの上端に合わせます。脳の輪郭を永久マーカーでアクリルプレートになぞります。

各プレートにテンプレートや脳トレーシングの番号に合わせてラベルを付けてください。バンドソーを使って、コピーしたテンプレートラインに沿って各プレートを切ります。あるいは、木彫りの先端が付いた回転型工具を使って不要な部分を取り除くこともできます。

切削刃は研磨用の研磨先端付きの回転工具で刃を滑らかにし、鋭い刃はスライス中に脳を傷つける恐れがあります。アクリル板をテンプレートの上に重ねて切断の精度を再確認してください。必要に応じてトリムやポリッシュを行ってください。

次に、プレートの組み立て方を説明します。プレートを順番に積み重ねてマトリックスを組み立て、プレートの配置を確認してください。マトリックス組み立ては、最初のアクリル板に3本の長いステンレスボルトを通し、すべてのネジにワッシャーを取り付けることから始まります。

2枚目のプレートを置き、各ネジにワッシャーを追加します。あるいは、ワッシャーをアンカー穴の周りに瞬間接着剤で接着することで、各組み立て時に個別にワッシャーを追加しなくて済む方法もあります。この工程を繰り返し、すべてのプレートがボルトに順次追加されるまで続けます。

すべてのボルトにナットを付けて締め付けてください。最終的に脳に向かったエッジを磨き、プレートからプレートへのスムーズな移行を実現します。異なる色のマーカーを使って、アクリル板の上端を交互に色分けてスライスを楽にします。

ここでは黒、赤、無印のナンバープレートを交互に使いました。最後に、冠状面または矢状面のいずれかで脳を切断する過程を示します。脳をスライスするには、成形過程と同じ向きでできるだけまっすぐにマトリックスに入れます。

脳を切るには幅広く平らな刃が必要です。広い刃はスライス中のねじれや曲がりを制限します。私たちは高プロファイルなクライオスタットブレードをおすすめします。

安全のため、刃の片端を約2センチの長さをラボテープで巻き、脳を切断する際に包帯端を安全に保持できるスペースを作ります。注意点として。ホルマリン固定後の脳の各部位の組織感が異なるため、刃に均一な圧力をかけるよう注意が必要です。

さらに、子豚の脳は大きいため、直接押す切断よりも切る動作で脳を切る方が良いです。刃は片側からもう片側へ一定の力で引き抜き、脳全体を切り裂くほど深く動かす必要があります。すべてのスライスをPBS入りの6ウェルプレートまたはステンレストレイに入れます。

スライスを慎重にトレイに並べ、スライスの順序と向きを保ち、必要に応じて保存または進めてください。脳により適合するように形状を調整したり空洞を拡張したりするために、選択されたアクリルプレートを取り外したり追加したりして、異なる脳サイズに適応させることができます。ここでは、P5子豚脳用に構築された矢状マトリックスの拡張を示し、マトリックスの中央部分に青と緑のプレートを複数追加します。

このマトリックスは現在、P38子豚の矢状体切片に適しています。マトリックスのサイズを拡張または縮小できる能力は、マトリックスの柔軟性を大幅に向上させ、材料と労力の両方を節約できます。冠状切片と同様に、矢状面で脳を慎重に切断し、連続したプレートで刃を誘導します。

色分けシステムは、薄いスライスでは難しい刃の正しい順番位置を特定するのに役立ちます。脳をマトリックスから取り出し、スライスを優しくほぐします。結論として、私たちは新生児子豚の脳マトリックスを作成するための簡単でコスト効率的かつ柔軟な方法を開発しました。

この概念は、年老いた豚や他の大型動物モデルにも適用可能です。