スペクトル共焦点顕微鏡を使用したハイプレックスイメージングにより、非特異的組織蛍光を最小化

ヘパリン遮断とスペクトル検出を組み合わせたIBEXワークフローを最適化し、好酸球豊富なヒト組織の背景を抑制します。自己蛍光と好酸球顆粒結合は真のシグナルを曖昧にします。両方をターゲットにして、クリーンな高プレックスマップを実現しています。

まず、ガラススライドの上にパップペンを使って埋め込まれた組織の周りに円を描き、疎水性バリアを作ります。各組織に約100マイクロリットルのPBSを加えて再水和させ、室温で約2分間培養して最適な切断温度の化合物を洗い流します。吸引ガラス製パスツールピペットを使って組織の周囲からPBSを吸引します。

次に各組織に100マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、室温の湿度チャンバーで1時間培養します。次にピペットでブロッキングバッファーを吸引します。各組織に100マイクロリットルの染色剤を混ぜ、冷蔵庫内の湿度がかかった室内で4度の温度で一晩培養します。

同様に、蛍光色素のスペクトルと組織の自己蛍光を定義するために、1つの蛍光色素のみで染色し陰性対照を施した切片を準備します。染色液を吸引した後、組織をPBSで3回洗い、洗った後は液体を吸引します。サンプルを顕微鏡に取り付けてイメージングします。

明示場または微分干渉コントラストモードで試料にフォーカスします。その後、蛍光モードに切り替え、実験要件に応じてスペクトル取得パラメータを設定します。実験で使用される蛍光分子に適切なレーザーを割り当ててください。

選択したレーザーラインに対応するビームスプリッターを選択します。すべての検出器が全発光スペクトルを捕捉できるようにし、画像取得解像度をあらかじめ定義された解像度のいずれかに調整します。あるいは最大解像度を選んでください。

最適な光学的断片のためにピンホールサイズを1面積単位に調整してください。取得前にレーザー設定を最適化してください。すべてのマーカーで染色したセクションを使い、低レーザー出力で連続スキャンモードを開始します。

各検出器のマスターゲインとレーザー強度を調整し、すべてのマーカーが良好な信号対背景比で識別できるようにします。レーザーの強度を微調整し、単一染色と多染色の断片を交互に繰り返し、すべての蛍光色信号が過剰飽和なく見えるようにします。取得ソフトウェアでタイル機能を有効にし、組織の周囲にタイル取得領域を定義して画像全体をカバーします。

組織の中心にあるタイル取得領域に焦点を最適化します。識別可能な配置にある独自の細胞群など、独自の構造的特徴を特定し、後の画像診断ラウンドでのアライメントの基準となります。次にZスタック機能を有効にし、Zスタックタブに移動します。

中央タブの下で、スライスの数を少なくとも6枚に設定し、スライス間隔は1マイクロメートル以上保持します。センターボタンをクリックして、前のステップで決定した現在のフォーカスポイントをスタックの中央スライスとして設定します。画像取得を開始するには実験開始ボタンをクリックしてください。

取得が完了したら、画像のサムネイルを右クリックし、「名前を添えて保存」を選択してください。ファイルの場所を選択し、画像名を付けます。画像データを安全なストレージにバックアップしてください。タイル領域取得時に適用した最適化設定と同じ方法で画像をアンミックスします。

各単一染色対照からスナップをキャプチャして真の信号スペクトルを得、染色されていない対照からは背景または自己蛍光を捕捉します。これらの画像はスペクトルアンミキシング専用に使用してください。選ばれた領域が真のシグナルであることを確認し、未染色対照群の強度や形態が背景レベルと同等であるか、マーカーの局在が膜、核、細胞質、分泌分布などの期待される細胞パターンと一致しているかを確認します。

ソフトウェアでスナップイメージを開いてください。アンミックスタブをクリックし、アンミックスツールタブの下にあるリージョン選択ツールのいずれかを選択し、正の信号の周囲に関心領域またはROIを描いてその領域のスペクトルを生成します。生成された各スペクトルを対応する蛍光色素の理論的な発光スペクトルと比較します。

その領域が真の信号を正確に表していることを確認しましょう。各スペクトルに蛍光分子の識別子に従って名前を付け、スペクトルデータベースに保存します。次に、タイル画像を読み込み、アンミキシングツールを開きます。

プラスボタンを使って、各蛍光分子の基準スペクトルをアンミックスリストに追加してください。リニアアンミキシングボタンをクリックするとスペクトル信号を分離し、未混合画像を保存できます。漂白液をフムフードで準備します。

マイクロヘラを使って、10ミリグラムのホウ水素化リチウムを直接乾燥ビーカーに重ります。ビーカーに10ミリリットルの超純水を慎重に加え、化合物が完全に溶けるまで混ぜます。各組織セクションに約100マイクロリットルの新たに調製した漂白液を加え、ガスパーチのピペットを使ってスライドを室温で15分間煙幕内で培養します。

漂白中のブリリアントバイオレットが死んだ場合は、スライドを慎重にエピフルオロッセンス顕微鏡に移し、ダッピーフィルターを選びます。サンプルを集中させ、全パワーで照らします。次に5倍の対物レンズを使ってより広い照度を得て、ステージを完全に下げてスライドと対物レンズやハウジングの接触を防ぎます。

最後に、ガラス製パスツールピペットを使って各井戸からホウ水素化リチウム溶液をデカントし、元の漂白溶液のビーカーに戻します。スライドを希釈バッファーで3回洗い、各洗浄中に約3分間孵化します。抗体混合液を加え、先ほど示したようにサンプルを染色します。

未治療の鼻ポリープ組織では、CD3、CD4、CD20の染色で好酸球が豊富な領域で強い非特異的顆粒状蛍光が見られました。一方、真の膜局在シグナルは強度が低いものでした。5%脱脂乳での前処理では非特異的蛍光を完全に遮断できず、AF 532などの蛍光分子の信号強度も低下しました。

Dab前処理はCD20、CD3、CD4の非特異的蛍光を減少させましたが、DAPIおよびAF 532を含む複数のチャネルでの真の信号強度も低下させました。ヘパリンによる前処理は、CD3、CD4、CD20、DAPIに対して高いシグナル強度を維持しつつ、非特異的結合を効果的に阻害しました。ヘパリンは濃度依存的に非特異的シグナルを遮断し、10単位で完全に抑制され、高濃度では有害な影響は認められませんでした。

3トラックイメージングセットアップは取得時間を短縮しましたが、AF 594のPEチャネルへのブリードスルーを含むクロストークを導入し、複数のレーザー励起による組織の自己蛍光の強化も含まれていました。スペクトルイメージングはほぼすべてのバックグラウンドおよびクロストークを除去し、取得時間を短縮し、信号対バックグラウンド比率を改善しました。ヒトの鼻ポリープのスペクトルIBEX画像では、EpCAMによって示された上皮構造が確認されました。

CD3陽性およびCD20陽性リンパ球などの免疫細胞、CD31およびCD34を発現する血管などが含まれます。ヘパリン処理はシグナルを減少させることなく顆粒結合を除去し、IBEXサイクルを通じて強力な背景抑制を維持しました。スペクトルアンミキシングはブリードスルーを最小化し、自己蛍光は背景への信号を増加させ、マルチトラック共焦点撮影に比べてマルチパネル取得を大幅に高速化します。

これにより、堅牢な空間プロテオミクスや難しい組織が可能となり、正確な細胞状態マッピングや近傍レベルの解析を支援します。