薬物スクリーニングのための三次元脳腫瘍スフェロイドの代謝プロファイリングの進歩

この研究は、臨床的に関連するモデルにおける細胞の行動代謝活性と薬物応答に焦点を当て、Seahorse テクノロジーを使用してエネルギー代謝を研究するための 3D 細胞根形成を最適化することを目的としています。この発見は、脳腫瘍のより正確な表現を提供し、治療評価を改善し、より良い治療戦略のための代謝分析を提供することにより、薬物鋳造モデルを強化します。この結果は、3Dスフェロイドモデルでエネルギー代謝がどのように変化するか、薬物がどのように排出されるか、代謝経路への影響、および代謝変化が治療に対する腫瘍耐性の発生に寄与するメカニズムを調査するための道を開きました。

採取したU87細胞をDMEMに再懸濁した後、未使用の培地を摂氏37度に予熱します。細胞懸濁液を室温で30分間維持します。初期細胞数に基づいて、細胞懸濁液を10%FBSを含むDMEMで最終容量20ミリリットルに希釈し、約200, 000細胞を確保します。

反転を繰り返すことで、最終的な細胞懸濁液を完全に混合します。透明な丸底超低付着96ウェルプレートに各ウェルの端に沿って200マイクロリットルの懸濁液をゆっくりと加え、遠心分離中の漏れを防ぐためにプレートをパラフィルムでしっかりと密封します。密封されたプレートを遠心分離機に入れ、200 Gで2分間実行して、各ウェルの底にある細胞をペレット化します。

遠心分離機からプレートを取り外します。パラフィルムを慎重に取り除き、プレートを5%二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに入れます。コーティング溶液を調製するには、5ミリグラムのポリ-D-リジンを50ミリリットルの滅菌水に溶解し、完全に溶解するまで溶液を完全に混合します。

代謝アッセイプレートの各ウェルに30マイクロリットルのコーティング溶液を加えます。プレートを軽く振るか、余分な溶液を吸引して、気泡がないことを確認します。カバーをかぶせた状態でプレートを室温で20分間インキュベートし、コーティング溶液を吸引し、ウェルを200マイクロリットルの滅菌水で2回洗浄します。

プレートを少なくとも30分間自然乾燥させた後、二酸化炭素なしでプレートを摂氏37度で30分間加熱してコーティングを安定させます。その後、各ウェルに175マイクロリットルの予熱培地を加えます。細胞スフェロイド移植の準備が整うまで、プレートを二酸化炭素を含まないインキュベーター内で摂氏37度に保ちます。

5日間の培養後、スフェロイドプレートをハイコンテントイメージングシステムに移します。イメージングパラメータを設定するには、温度を摂氏37度に、二酸化炭素レベルを5%に設定します。システム設定でプレートの種類、チャンネル、焦点範囲を調整します。次に、10倍対物レンズを備えた共焦点顕微鏡とイメージングソフトウェアを使用してスフェロイド画像を取得し、無傷のスフェロイドを含むウェルを特定し、それらの位置を記録して転送します。

無傷のスフェロイドを2つのグループ、6つの複製ウェルを持つ対照群と、フェノフィブラート治療のために6つの複製ウェルを持つ治療グループに割り当てます。フェノフィブラート作業溶液を新鮮な予熱培地中で最適な濃度で調製します。低付着プレートを含むスフェロイドをイメージングシステムから慎重に取り外し、バイオセーフティキャビネット内の無菌面に置きます。

ポリ-D-リジンでコーティングされたアッセイプレートを移送のために隣接して配置し、20マイクロリットルのピペットの先端をトリミングして、損傷を与えることなく細胞スフェロイドを穏やかに吸引できるようにします。トリミングしたピペットチップを使用して、ウェルの底から無傷の各スフェロイドをそっと吸引します。各スフェロイドをコーティングされたプレートの対応するウェルに移し、20秒間沈降させます。

3Dスフェロイドアッセイプレートをハイコンテントイメージングシステムに移します。形態データを解析するには、テクスチャ領域モジュールを適用して、テクスチャ特徴に基づいて画像コンテンツを3つのクラスターに分割することで、背景から3Dスフェロイドを大まかに分離します。画像領域の検索モジュールを適用して、体積ベースのサイズ特性を使用して事前に単離された3Dスフェロイドの分離を微調整し、不純物が除去され、無傷のスフェロイドが保持されるようにします。

形態特性モジュールを使用して、3D回転楕円体の形態パラメータを測定します。選択集団モジュールを適用して、本物の3D細胞スフェロイドのみをフィルタリングして保持し、形態学的データの結果をエクスポートします。スフェロイドは培養5日目までに目に見えて形成され、観察されたすべてのサンプルで均一な球形の形態を維持しました。

構造的完全性が目に見えて破壊された崩壊したスフェロイドも5日目に観察されました。移植後の分析により、対照とフェノフィブラート処理された3Dスフェロイドの両方がほとんどの場合無傷のままであることが明らかになりましたが、一部のフェノフィブラート処理されたスフェロイドは崩壊しました。酸素消費率は、対照群と比較して、すべての時点でフェノフィブラート処理されたスフェロイドで有意に減少しました。