2025年10月10日
このプロトコルは、非小細胞肺がん(NSCLC)ホルマリン固定パラフィン包埋組織における標的化可能なゲノム変化を検出するための、自動化されたISO15189認定の次世代シーケンシングワークフローを記述しています。
私の研究は、がんにおける遺伝子変異を発見し、診断と治療の改善を目指しています。まず、検査室情報管理システムにサンプル情報を登録し、遺伝子変異検査のためのインフォームドコンセントフォームに記入してください。使い捨てのマイクロトームブレードを使用し、非小細胞肺がんから切断し、正式および固定パラフィン埋め込みサンプルを採取しました。
その後、腫瘍細胞の成分を評価するために、定期的なヘマトキシリンとエオシン染色を行います。核酸抽出では、ミクロトームを用いて、正式かつ固定されたパラフィン埋め込みブロックを切断してリボンを得て、リボンを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に入れます。自動抽出装置の指定されたサンプル入力位置にチューブを移します。
次に、自動抜歯器具と自動抜歯キットを使いましょう。手動ピペッティングの代わりに、自動磁気ビード核酸抽出システムに置き換えましょう。次に、機器のC1102プログラムを選択します。
サンプル脱ワックスの培養時間を16時間とし、エルシアン体積を100マイクロリットルに設定します。分光光度法を使ってDNAの純度を検証します。次に、配列特異的蛍光染料を用いた検出キットを使い、正確なDNA濃度測定のためにフルオメトリックアッセイを行います。
超音波処理を用いて断片ゲノムDNAを製造するには、200ナノグラムのゲノムDNAを50マイクロリットルの低tris-EDTAバッファーに混合します。サンプルチューブを予備冷却されたサンプルラックに置き、温度は8度に保ちます。プロトコルに従って装置パラメータを設定し、DNA断片化を開始します。
自動ライブラリ準備を開始するには、電源ボタンを押してシステムを起動し、初期化が完了するのを待ちます。プログラム設定に移動し、プロトコルを実行し、プロトコルBurningRock HSを選択してください。サンプルタイプを高品質DNAに設定し、入力量ナノグラムを50に、PCR前サイクルを12に、PCR後のサイクルを12に設定します。次に「実行」をクリックして進めてください。
その後、あらかじめパッケージされた試薬カートリッジを機器の指定スロットに挿入すると、試薬の配置と状態が自動的に検証されます。サンプルを読み込んだら、スタートボタンを押して自律実行を開始します。システムのLEDインジケーターを見て進捗を監視してください。
プログラム終了後、OKをクリックして確認すると、システムが自動的に最終ライブラリーをライブラリチューブに転送し、ライブラリ準備が完了します。フルオロメトリーを用いて、前ライブラリーおよび全ライブラリーの濃度を測定します。シーケンス操作のためにシーケンスライブラリを1.6ピコモラーと1300マイクロリットルに希釈します。
室内温度と湿度を維持することでシーケンス環境を制御します。機器出力データの品質を完全に制御し、Q30を超える基準品質とクラスタ密度通過フィルターの検証を行います。最適化された検出ワークフローにより、代表的な腫瘍サンプルから臨床的に有効なゲノム変異をいくつか確実に特定しました。
シーケンス結果は高周波のEGFR pを示しました。L858Rミセンス変異と、著しいEGFR遺伝子コピー数増幅を伴う。MET遺伝子の中程度の増幅が観察され、BRAF遺伝子の低レベルの増幅が観察されました。
サンプルは中間的な腫瘍変異負荷とマイクロサテライト安定状態を示しました。ALK、BRAF、KRAS、ROS1を含むすべての標的遺伝子座は、4つの重複実験で100%の検出率を達成しました。各変異は4回の繰り返し実験すべてで一貫して検出され、期待される存在比値は正常な変動範囲内に収まりました。NJSは、一般遺伝子、希少遺伝子、新規遺伝子を同時に検出することで、非小細胞肺がんの圧縮遺伝プロファイルを提供します。
今後の研究は、分子病理学と人工知能を組み合わせて肺がんの新しいバイオマーカーを探ることに焦点を当てます。
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このプロトコルは、非小細胞肺癌(NSCLC)のホルマリン固定パラフィン包埋組織における標的可能な遺伝子組換えを検出するための、自動化されたISO15189認定の次世代シーケンシングワークフローを説明しています。このプロセスには、サンプル登録、切片、および核酸抽出が含まれます。
Comprehensive detection of actionable genomic alterations in non-small cell lung cancer (NSCLC) is critical for precision oncology and portfolio advancement. Automated, ISO15189-certified next-generation sequencing (NGS) workflows enable high-confidence identification of mutations, fusions, and amplifications, supporting robust target validation and risk-adjusted decision-making. Standardized, reproducible NGS processes reduce technical variability and accelerate translational research integration.
This NGS workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by delivering high-fidelity genomic data from clinical NSCLC samples.