脳オルガノイドを用いたミトコンドリア疾患のモデル化:ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソードに焦点を当てる

私たちの研究範囲は、ミトコンドリア疾患計の理解と治療薬の発見です。技術にオルガノイド形成が含まれているにもかかわらず、高スループットアッセイの能力を維持することが課題です。まず、誘導多能性幹細胞培養プレートが約70〜80%の合流度に達した時点で培地を除去します。

細胞をPBSで洗いましょう。細胞に酵素溶液350マイクロリットルを加えて培養します。反応を止めるために800マイクロリットルのステムフィット培地を加えます。

細胞懸濁液を新しいチューブに移した後、190Gで22度Cで5分間遠心分離します。次に、ペレットを1ミリリットルの分化培地に再懸浮させます。細胞数を数えた後、U字型の96ウェル低付着プレートの各ウェルに100マイクロリットの3000細胞をシードします。

37度の環境で6日間、5%の二酸化炭素で培養します。インキュベーション後、ワイドボアピペットを使って96ウェルプレートからオルガノイドを10センチメートルの皿に移します。新しい96ウェルプレートの各ウェルに50マイクロリットルの補充されたDMEM/F12培地をピペットで注ぎます。

オルガノイドを2ミリリットルの管に集めます。オルガノイドを吸引せずに培地を慎重に取り出し、補足したDMEM/F12培地を1.5ミリリットル追加してください。最後の洗浄液をピペットで抜き取ったら、新しい培地を500マイクロリットル加えます。

次にオルガノイドを10センチの皿に移します。各オルガノイドを採取しやすくするために培地を5ミリリットル加えます。すべてのオルガノイドを50マイクロリットのマイクロピペットで96ウェルプレートの各ウェルに移し、3日間培養します。

9日目にオルガノイドを2ミリリットルの管に集め、DMEM/F12で3回洗浄します。その後、オルガノイドを再び分離培地に懸浮させます。1ウェルあたり約10個のオルガノイドを6ウェルプレートに移し、各ウェルの最終的な媒体量を2ミリリットルに調整します。

プレートを37度の温度で6日間、5%の二酸化炭素で静的に培養します。15日目にオルガノイドを15ミリリットル管に集めます。チューブを静置した後、ピペットで上清液を抜き、B27とビタミンAを補足した新しい分化培地を加えます。

1ウェルあたり約10個のオルガノイドを6ウェル板に移します。オルガノイドを37度C、5%二酸化炭素で15日間静的に培養します。培養皿に希釈したポリL-オルニチン溶液を塗布します。

プレートは37度の温度で一晩孵化します。翌日、PBSで井戸を3回、それぞれ5分間洗浄します。次に、希釈したラミニン溶液を井戸に加えます。

プレートを37度の温度で3時間、または一晩孵化させます。オルガノイド懸濁液を200Gで5分間遠心分離します。上澄液を取り除き、酵素溶液を1ミリリットル加えます。

よく混ぜて37度で5分間培養してから遠心分離します。上清液を除去し、分散液を1ミリリットル追加した後、懸濁液の下に慎重に分離液を重ねます。その後、サスペンションを200Gで遠心分離機で5分間加熱します。

次に、チューブに1ミリリットルのニューロン培地をピペットに入れます。溶液を混ぜ、70マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにサスペンションを通します。細胞数を数えた後、ポリL-オルニチンおよびラミニン被覆プレートに1平方センチメートルあたり100,000セルの密度で細胞懸濁液をシードします。

60日目までは4〜7日ごとにミディウムを交換してください。免疫蛍光のためにオルガノイドを固定するには、まずマイクロチューブに収穫します。オルガノイドをPBSで洗い流し、その後室温で4%のパラホルムアルデヒドに30分間固定します。

固定後、固定オルガノイドをPBSで3回洗浄します。オルガノイドは使用まで4度の温度で保存してください。2次元神経細胞培養のシードから30日後、培地をプレートから取り出します。

その後、細胞をPBSで洗浄します。細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定します。パラホルマルデヒドをピペットで取り出し、その後PBSで細胞を3回洗浄します。

固定セルは使用まで4度の温度で保管してください。RTQPCR用にオルガノイドを採取するには、マイクロチューブに移管します。PBSをチューブ内にピペットで挿入してオルガノイドを洗浄します。

次に、オルガノイドに350マイクロリットルの溶解バッファーを加え、液体窒素でスナップ冷凍します。使用まではマイナス80度の温度で保管してください。FOXG1陽性ニューロンを含む脳オルガノイドは、健康な対照群であるIPSC系統414C2から30日目に誘導され、60日目には2D培養されたニューラルネットワークを得ました。

M.3243AからG変異株のヘテロプラズミーレベルはQPCRによって確認されました。2番から8番線は低い異質性、2番から6番目の系統は高い異質性でした。低異質性系統から派生した脳オルガノイドは、健康な対照群と似た大きさと形態を示しました。

高ヘテロプラズミー系2から6から生成されたオルガノイドは、0.3平方ミリメートルの縮小したサイズと、円形度0.82の不規則な形態を示しました。414C2系統および2〜8系統から誘導されたほとんどのニューロンは、30日目と60日目にFOXG1陽性でした。FOXG1陽性ニューロンは、2線から6線由来のオルガノイドや2次元培養ニューロンでは稀に検出されていました。

私たちの結果は、患者由来のIPSCベースのオルガノイドモデルがミラー、メカニズム、薬物スクリーニングの研究に有用なプラットフォームであることを示唆しています。従来の方法では、培養時間が短く費用対効果が高いため、MELISの病態生理を調査するための実用的なツールを提供します。将来的に患者を排出した化合物を用いてMELISの潜在的な薬剤を探したいと考えています。