Name: 三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-12T19:12:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶ ホットエンボス加工とマイクロサーモフォーミングを用いた多孔質ポリマーチップの製造法。イオントラック技術を活用し、三次元細胞培養用足場を効率的に作製する革新的な微細加工技術を解説します。

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著者らは、溶媒蒸気の溶接に関する彼らの実質的な助けのためにダークヘルマン、オリバーウェント、ジークフリートホーン、ムートグートツァイト、とイェルクボーンを感謝したい。さらに、我々は彼らの技術支援のためにマイケルハルトマン、アレックスGerwald、とダニエルライゼンに感謝します。

プロセスのシーケンス＃1：ホットエンボス、加工および溶剤蒸気の溶接そのキュービックデザインのCellChipは、ホ​​ットエンボス加工やマイクロ射出成形によって複製されます。このため、我々は、チップの逆形状と微細加工真鍮の金型を使用してください。コンテナ - 1156コンテナまでの規則的なアレイ状に配置されたが - 300μmの辺の長さを持つ立方体のデザインを持っている。ホットエンボス加工の場合は、レプリケーションプロセスは、従来のWUM02（Jenoptik Mikrotechnik、ドイツ）で行われます。ツールは2つの円形の金属板で構成されています。最初のステップでは、薄いPMMAプレート（Lucryl、G77Q11、BASFが）開いたツールの下のプレートの中央に配置されます。微細金型のインサートはcentrically上部のプレートに取り付けられている。その後、ツールは、金型の避難のために閉鎖し、ポリマーのガラス転移温度より高い温度に加熱される。それらが完全に正確に金型の形状を複製いっぱいになるまで一緒にプレートを押すことで、粘性のポリマーは、真空にキャビティにプッシュされます。ツールを冷却した後、微細ポリマー部分がdemouldedすることができます。プロセスは、実際に金型の空洞を埋めるために必要以上のポリマーの質量が必要です。ポリマーの剰余金は、一部の離型を容易にするために使用することができる残留層を形成する。しかし、容器の底には3μmより小さい直径の孔を作成するには、厚い残留層がダウンして薄くする必要がある、あるいは完全に多孔質膜で取り外し交換。細孔の統合のプロセスを簡素化するために、複製されたCellChipの背面は完全にダイヤモンドの工場で機械加工により除去される。このため、部品が冷却取付板に固定されており、さらに、脆弱な構造が損傷に対してそれらを保護するために、脱イオン水で凍結されています。 最後の工程で、最終的に商業的なイオンのトラックエッチメンブレン（ポリカーボネート、厚さ10μm、孔径3μmの、2 × 10 6ポア/ cm ²の、ピーパーフィルター社）はコンテナの配列の後ろに結合している今の両方を開設上部と下部。接合プロセスは、気密、加熱室[図行わ溶剤蒸気の溶接プロセスです。チャンバーを排気した後、1]、上側のプランジャーと統合された真空チャックと可動側プレートで構成される。4は最大4つの機械加工CellChipsとトラックエッチメンブレンには、気化溶剤を並列にさらされている。その後、成形品と膜は、上部プランジャーで一緒に押されている。露出（&lt;15秒）の短い期間の後、チャンバーは再びそれによって溶媒を除去する排気される。短い接触時間のために、材料に近い表面のみが溶解され、機械的負荷に起因するバルク構造の変形を避けることができます。最後に、チャンバーが開かれ、溶剤溶接CellChipsを除去し、細胞培養[図のために調製することができる。 2]。 <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png" alt="図1" width="100" /></a> 図1。 <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png" alt="図2" width="100" /></a> 図2。 プロセスのシーケンス＃2：重イオン照射、microthermoformingとトラックのエッチング（SMARTプロセス） SMARTと呼ばれる新しいプロセスは、機能性膜のような微細構造を製造するため、最近開発されたマイクロテクノロジーです。5テクノロジが&quot;microthermoforming&#39;と呼ばれる、microtechnical熱成形プロセスに基づいている。肉眼から適応されたこの中央のプロセスステップにおいて、6,7シート熱成形プロセスを閉じ込め、加熱された高分子薄膜を金型キャビティ[図へのガスの圧力によって、その軟化、ゴム弾性状態で形成される。 3]。ホットエンボス加工または射出成形とは異なり、このプロセスは、プライマリ形成ではなく、ポリマーを溶融されていません。フィルムは永久的な材料の凝集固体状態ではまだ形成されているという事実のために、高い横方向の解像度を持つ材料の変更は、第一の平面高分子膜上に生成することができ、成形過程で保存されます。 microthermoformingステップの後、これらの変更は、さらに選択的に湿式化学処理により、例えば、処理することができます。 <img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_9/Giselbrecht-Fig3.png" alt="図3" width="400" height="217" /> 図3 原則としてSMARTプロセスは、以下の3つのプロセスの手順で構成されます。 <ol><li>プリプロセスの平面薄いポリマーフィルム上で高度に解決した変更のパターンの作成</li><li> 3D SHAP（パターン）を失うことなくmicrothermoformingによるフィルムのINGの修正</li><li>薄肉微細部品の最終的な官能化のためのポストプロセス（オプション） </li></ol>我々は現在、多孔CellChipsの製造に適用されているSMARTプロセスは、以下の工程[図を含みます。 4]。薄いポリマーフィルム、ポリカーボネート（Pokalon OG461Gl、50μm以下、LoFoハイテク映画社、ドイツ）からの例は、、（ダルムシュタット、GSIの加速器施設での加速、重イオン（例えばキセノン、AuまたはUのイオンなど）を照射し、約のエネルギーを持つドイツ）。 1 GeVのと工具を冷却した後、106 8の順にフルーエンスは、薄肉部がdemouldedすることができます。イオン/ cm ²。フィルムを貫通する場合は、各イオンは、潜在的なトラックと呼ば​​れる、変更された材料のほぼまっすぐな道を生成します。前処理されたフィルムはその後、25 × 25薄肉microcontainers、300μmの直径と深さとそれぞれの配列に熱成形されています。プロセスは、現在、修正されたホットエンボスプレス[図で実行されます。高分子フィルムを2枚の金属板との間にクランプされている5]、。上部のプレートは、微細加工金型を装備し、小さい方が圧力と真空コネクタが含まれています。フィルムは、最大5 MPaまでの圧力で窒素による金型の以前に排気したマイクロキャビティに引き伸ばされている。フィルムは、アニールトラックを防止するため、そのガラス転移温度近傍に形成されています。 <img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_10/Giselbrecht-Fig4.png" alt="図4" width="400" height="119" /> 図4 <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png" alt="図5" width="100" /></a> 図5 ポストプロセスでは、イオントラックを選択的に適切なエッチング媒体（例えば、5モル/ L水酸化ナトリウム、10％（w / v）のメタノール）に全体の微細構造を浸漬することによって毛穴にエッチングされています。エッチング時間を制御し、そのような濃度、温度および特殊添加剤（例えば、エッチプロモーター）などの条件を、エッチングすることにより、結果として得られる細孔の大きさと形状は、[図を調整することができます。 6]。 <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png" alt="図6" width="100" /></a> 図6

<ol><li>Knedlitschek, G., Schneider, F., Gottwald, E., Schaller, T., Eschbach, E., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-like+culture+system+using+microstructures%3A+influence+of+extracellular+matrix+material+on+cell+adhesion+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A tissue-like culture system using microstructures: influence of extracellular matrix material on cell adhesion and aggregation.</a> J Biomech Eng. 121, 35-39 (1999).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmüller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Heckele, M., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+micro+molding+of+thermoplastic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+And+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Review on micro molding of thermoplastic polymers.</a> Journal of Micromechanics And Microengineering. 14, (2004).</li>
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<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed Microdevices. 8, 191-199 Forthcoming.</li>
<li>Truckenmüller, R., Rummler, Z., Schaller, T., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+thermoforming+of+micro+fluidic+analysis+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Low-cost thermoforming of micro fluidic analysis chips.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 12, 375-379 (2002).</li>
<li>Truckenmüller, R., Giselbrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microthermoforming+of+flexible%2C+not+buried+hollow+microstructures+for+chip-based+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEE+Proc.-Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Microthermoforming of flexible, not buried hollow microstructures for chip-based life sciences applications.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 163-166 (2004).</li>
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</ol>

このようなマイクロ射出成形または熱エンボス加工のようなポリマーのmicroreplicationの確立された方法は、微細構造を製造するのに適しているが、彼らはCellChipのために必要とされる様に、統合と高度に制御された多孔度を有する微細構造を製造するのに本当に効果的ではありません。バルキーな構造は、例えば、その後のレーザー穿孔のために壁の厚さを減らすために高価な機械加工を必要とするか、壁には完全にトラックエッチメンブレンで置換する必要があります。 SMARTは、これらの問題を克服し、大量生産に適していることができる新しいし、有望な技術です。視点が巨視的な部品の生産ラインと同様のロール紙による薄肉微細、の製造が含まれています。また、ゴム弾性状態にあるポリマーフィルムの形成は、すべての構造（垂直側壁を含む）上で定義されている毛穴を作成するだけでなく、生理面のパターン、塗料のような高度に解決した官能化で微細構造を提供するだけでなく、機会を提供していますとさえほとんどアクセス可能な、例えば、マイクロ流体キャビティ内トポロジ。

三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

微細加工技術を使用すると、三次元細胞培養のための再現可能な幾何学と一定の品質の足場を作るための前提条件です。これらの技術は、製造業のためだけでなく、さまざまなアプリケーションのためだけでなく、利点の広いスペクトルを提供しています。形成された細胞のクラスターのサイズと形状は、微細加工足場の正確で再現性のあるアーキテクチャの影響を受け、したがって、栄養素とガスの拡散パスの長さがcontrolled.1することができますこれは紛れもなくのアポトーシスと壊死を防ぐために有用なツールですできます不十分な栄養とガスの供給や携帯代謝物の除去に起因する細胞。 CellChipと呼ばれる私たちのポリマーチップは、中央の微細構造の面積は2 × 2cmの外寸を持っています。このエリアは、キュービックデザインの300メートルの一辺​​の長さ（CP -またはCF -チップ）のまたはラウンドデザイン（R -チップ）は300 mの直径と深さの典型的なディメンションを持つ1156 microcontainersまでの配列に分割されます。 2 これまでのところ、ホットエンボス加工やマイクロインジェクション成形は、（部品のその後の面倒な機械加工との併用）微細チップの製造に使用した。基本的には、マイクロ射出成形は、今まで、しかしポリマーmicrostructures.3の大量生産のための可能な、唯一のポリマーベースのレプリケーション技術の一つであり、両方のテクニックは、世代と溶融粘度のポリマーの処理に起因する特定の不必要な制限があります。非常に薄い壁や穴に統合。 CellChipの場合には、薄底の層は、ポリマーを穿孔し、容器のマイクロ流体灌流により培養液の例で細胞を供給するために定義されたサイズの小さな孔を提供するために必要です。 これらの制約を克服するために、我々はダウンスケーリングされた熱成形プロセスに基づいて新しいmicrotechnicalアプローチを開発して製造コストを削減するために。高度に多孔性と薄肉ポリマーチップの製造のために、我々は、重イオン照射、microthermoformingとトラックのエッチングの組み合わせを使用してください。このいわゆる&quot;SMART&quot;プロセス（熱成形による基板変形と複製）に薄い高分子膜は、いわゆる&quot;潜在的なトラックは&quot;その後、ゴム弾性状態のフィルムを3つに形成されて導入し、数百MeVの高エネルギー重投射物に照射されていますトラックを変更したり、アニーリングなしの次元の部品。成形工程の後に、選択的化学エッチングは、最終的に調整可能な直径の円筒状の孔にトラックを変換します。

我々は、三次元細胞培養用多孔性ポリマーチップの微細加工のための2つのプロセスを提示する。最初のものは、溶剤蒸気の溶接プロセスと組み合わせて熱エンボス加工です。もう一つは製造の大幅な簡素化につながるイオン飛跡技術と組み合わせた最近開発microthermoformingプロセスを使用しています。

3次元細胞培養のために、再現性のある形状と一定の品質を持つスキャフォールドを作製するには、微細加工技術の使用が前提条件となります。

こんにちは、私はStefan Reです。生物学的界面研究所に所属しています。本記事では、「チップ」と呼ばれる微細構造スカフォールドの作製プロセスについて解説します。これらのチップの作製には、ホットエンボス加工に特定の後処理を組み合わせた手法と、当研究センターで最近開発された「Squi」と呼ばれるマイクロサーマルフォーミングプロセスの2つの異なる手法を用いています。現在はクリーンルームテントにおります。右側に見えるのが典型的な真空ホットエンボス機で、この装置を使用して微細構造セルチップを作製します。まず、微細構造モールドを導入します。これはこのようなプレートに固定されており、ここに2つの金型が見えます。この金型はマイクロマシン加工によって作製され、材質は真鍮です。それでは、この微細構造金型を装置に取り付けます。ホットエンボス加工プロセスでは、こちらのようなポリマープレートを使用します。通常、セルチップの作製にはポリカーボネートまたはPMAが用いられます。ここで、ポリマープレートを装置のプレート中央に挿入し、ツールを閉じます。装置を閉じた後、チャンバー内を真空にし、その後、金型またはツール全体を成形温度まで加熱し、加熱されたポリマーを微細構造を持つ金型にプレスします。この成形手順の後、金型全体を冷却し、装置内の自動脱型プロセスを行います。ここでご覧いただいているのは、成形部分を持つ成形済みセルチップで、2つのセルチップと、ホットエンボス加工によって生じた典型的な残留層が見て取れます。ホットエンボス工程の後、部品の残留層を薄くし、最終的に完全に除去する必要があります。そのため、金型部品などのパーツをトリミングし、このマウントプレート上に凍結させます。マウント後、パーツの背面で微細構造グリッドが開くように、残留層を一定の厚さまでミーリングします。ミーリング工程の間、マイクロコンテナの壁は凍結した水によって安定化されます。最終的に、上部が両側とも開いたMicroConコンテナの自立型グリッドを持つ、2枚の成形済みセルチップが得られます。次に、ミリング工程の後、これらの開口したMicroConコンテナアレイの底部に多孔質膜を接合します。市販の穿孔済みポリカーボネート膜をオープンセルチップの背面に接合し、微多孔性コンテナアレイを作成します。ここでは、薄いポリマー・トラックエッジ膜をこのチャンバーに挿入します。膜の厚さは約10 micronsの範囲であり、これらの膜の上にセルチップを配置します。その後、この空洞を密閉し、最初のステップとしてチャンバー内を真空にします。次に、気化した溶媒を注入してポリマーの表面を溶解させ、この積層体に圧力を加えることで、膜をセルチップに接合します。最終ステップとして、チャンバーを減圧し、完成したセルチップを取り出します。最近、私たちは熱成形プロセスに基づいたセルチップの新しい作製技術を開発しました。これはマイクロスケールに適応させたものであるため、マイクロ熱成形（micro thermoforming）と呼んでいます。多孔質セパレータを製作するため、加速重イオンを照射したポリフィルムを使用します。これはUnilog社の協力のもとで行われ、重イオンがポリマーフィルムを完全に貫通することで、フィルム内に直線的なトラックを形成します。その後、熱成形プロセスによってこれらの直線的なトラックが維持され、孔が形成されます。次に、これらのラテン格子のトラックを、定義されたサイズの細孔へとエッチングする成形工程が行われます。右側に、このマイクロサーマル成形プロセス用に適合させた装置が表示されています。これは、本プロセス向けに最適化されたホットエンボス機です。この装置は主に3つのパーツ、すなわち上部プレートと下部プレートで構成されています。これらにはガス加圧用および真空排気用のコネクタが備わっており、さらに天井のような3つ目のパーツがあります。最初のステップとして、厚さが約50から100µmの範囲の薄膜を挿入します。次にツールを閉じ、第2段階へと進みます。これら2枚のプレートと天井によって構成されるチャンバー内を真空にします。真空排気後、ポリマーフィルムをこれら2枚のプレートの間で加圧し、成形温度まで加熱します。成形工程です。ここでの温度はガラス転移温度の範囲内であり、これはポリマーが溶融しているのではなく、ゴム弾性状態にあることを意味します。続く工程で、ガス圧を印加します。ここではガスとして窒素を使用し、このガスによって、ゴム弾性状態のポリマーフィルムが、あらかじめ真空排気されたマイクロモールド内に引き延ばされます。この成形ステップの後、ツール全体を冷却し、ツールを開きます。最後に、マイクロ構造ポリマーフォームを手動で脱型します。この新しいプロセスの利点は、標準的なマイクロ射出成形プロセスやホットエンボスプロセスと比較して、工程数を劇的に削減できることです。熱成形したヘビーアイロンポリマーフィルムを用い、ラテン・トラックを選択的にエッチングして、定義されたサイズのポアを作成します。この工程では、シンプルなガラスビーカーのセットアップを使用し、水酸化ナトリウムでラテン・トラックをエッチングします。その際、緩やかに攪拌し、約60 °Cの温度まで加熱します。このエッチング手順は、異なるポアサイズを得るために、約1時間から数時間かけて行います。ここに、完成した2つの製品があります。1つは成形されたセルチップの背面にマイクロ孔膜を備えた、ホットアンドバス（hot and bused）セルチップです。そして左手にあるのが、真空成形による薄壁のフレキシブルセルチップです。これらは細胞培養に使用する前に、ガンマ線照射によって洗浄および滅菌されます。

microfabrication-chip-sized-scaffolds-for-three-dimensional-cell

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