内在コントラストを用いたDNA分子の分光超分解能イメージング

本研究は、DNA分子の固有蛍光スペクトルを測定するための初のプロトコルを提示し、その本来の光学特性や配列確認に関連する特性の調査を可能にします。このプロトコルは、DNA分光イメージングに内因性蛍光を利用し、既存の手法で誘導される標識による破壊、連鎖誤差、標識密度の不均一を回避します。まず、DNAサンプルをヌクレアーゼフリーの脱イオン水に溶かし、最終濃度100ミリモルにします。

繰り返しの凍結融解サイクルを最小限に抑えるために、DNAストック溶液を5マイクロリットル分準備します。余分なストック溶液入りのチューブは4度の温度で保管してください。実験室用ワイプでガラススライドを優しく拭き取ってください。

100ミリモラーのDNA溶液を5マイクロリットルピペットで洗浄したばかりのガラススライドに塗り、サンプルを1〜3時間乾燥させてDNAゲルを形成します。フームフードでは、β-メルカプトエタノールバッファーまたはDABCOイメージングバッファーのいずれかを準備し、DNA分子の確率的光スイッチングをサポートします。イメージングバッファー5マイクロリットルをDNAゲルにピペットし、サンプルの上にカバースリップを置きます。

もし蓋付きのサンプルの中に気泡がある場合は、ピンセットで取り除いてください。直径100ナノメートルの穴を含み、4マイクロメートル間隔で8行5列に配置された人工ナノホールアレイを取得します。sSMLM(スマリムシステム)をオンにし、カメラの正面に直接狭帯域フィルターを挿入します。

校正サンプルを顕微鏡の下に置き、顕微鏡ランプを点灯させてサンプルを照らします。すべてのフィルターで露光時間を200ミリ秒に設定し、750ナノメートルフィルターでは2,000ミリ秒に変更してください。取得してファストタイムラプスに行き、各フィルターのフレーム数を10に調整します。

キャリブレーション後、DNAゲルサンプルをカバースリップ側が対物レンズに向く顕微鏡ステージに載せ、カメラソフトウェアを開いてデータ取得を行います。自動フォーカストラッキングシステムを使って適切なZ位置を特定し、明確な確率点滅が見えるまでフォーカスを調整します。バッファーが浸漬油への漏れやトラッキングの妨げを防ぐために、対物レンズがカバースリップエッジに触れないようにしてください。

望ましい照明パワーと30ミリ秒の露光時間で約10,000〜30,000フレームを撮影します。データ取得後、ソフトウェアがデフォルトでデータをnd2形式で保存できるようにします。ガラススライドは割れたガラスや鋭利な物品用の認可されたゴミ箱に処分してください。

残りのバッファーはすべて、機関の安全ガイドラインに従って指定された化学液体廃棄物容器に捨ててください。Fijiを開いてbio formatsプラグインを使って、DNAサンプルの取得した生画像スタックを読み込みます。画像を選択し、その後スタック、Zプロジェクト、最小強度を投影タイプとして選択して、RAW画像スタックの最小投影を生成します。

画像計算機を選択し、生画像スタックから最小投影量を差し引いてください。背景で減算したデータセットをTIFファイルとして保存し、スペクトル解析を行います。次に、ThunderSTORMプラグインバージョン1.3を使ってゼロ次生画像スタックのローカライゼーション識別を行います。

閾値を標準偏差波の1.2倍に設定します。F1を3に、シグマを1.5にフィッティングしてゼロ次画像を再構成し、放出イベント座標を抽出します。トリミングされたゼロ次RAW画像スタックでは、プラグインを選択し、その後ThunderSTORMを選択し、解析を実行します。

フィジーおよびオープンソースソフトウェアRainbowSTORM(2020b年以降のMATLABバージョン)を使って校正データを処理し、水平・垂直のシフトや波長の関係を取得します。ThunderSTORMプラグインを使って5つの波長のキャリブレーション画像の位置特定を行います。閾値を標準偏差の5倍に設定し、波。

F1を半径を3にフィッティングし、シグマを1.5にして、ゼロ次ナノホール局在化と一次のスペクトル局在化を再構築します。各キャリブレーションデータの平均画像を取得し、標準偏差波の5倍から10倍の範囲内で閾値を調整します。各キャリブレーション画像に対してF1から80までのローカライゼーションが取得されます。

RainbowSTORMを実行し、スペクトルキャリブレーションの「ブラウズ」をクリックして各キャリブレーション波長のCSVファイルを読み込みます。その後、「キャリブレーションファイルを保存」をクリックしてキャリブレーションファイルを保存します。カスタマイズされたPythonスクリプトバージョン3.11.7を使って、全スペクトルデータを抽出してください。

その後、Pythonスクリプトで、前のバックグラウンド減算ステップからTIF形式の背景画像スタックの正しいファイルパスを設定します。ローカライゼーション解析ステップで生成されるローカリゼーションCSVファイルのパスと、キャリブレーションステップから生成されるMAT形式のキャリブレーションファイルのパスを設定します。次に、532ナノメートルのデータに対して水平シフトを925〜984ピクセルに設定し、3D DWPで取得した525〜980ナノメートルのスペクトルウィンドウに対応し、590〜650ナノメートルのフィルター範囲を超えるカバレッジを確保します。

RainbowSTORMで得られたスペクトルキャリブレーションカーブに基づき、3D DWPで取得した488ナノメートルおよび532ナノメートルのデータに対して、垂直シフトを23ピクセルに調整してください。最後に、非線形スペクトルを三次多項式フィッティングを用いて線形化し、その後の比較および分類解析を行います。スペクトルキャリブレーションが行われ、ゼロ次画像と一次次画像間の水平および垂直ピクセルシフトの測定が可能になりました。

これにより、ピクセル位置と波長の間にキャリブレーション曲線をマッピングすることが可能になりました。532ナノメートル励起下での非線形および変換線形放射スペクトルは、二本鎖DNA分子の一種を指すGCオルターに対して得られました。緑色の曲線は平均スペクトルを表していました。

A10C10(単鎖DNA分子の一種)の非線形および変換線形放射スペクトルは、488ナノメートル励起の下で取得され、青い曲線が平均スペクトルを表しました。このプロトコルにより、研究者は合成された単鎖および二本鎖DNA分子の内在蛍光スペクトルを分光超分解能イメージングで測定できます。正確なZ位置を特定することは極めて重要です。DNAゲルサンプルは構造情報が不足しており、確率的な点滅を観察するには注意が必要です。

今後の研究は、RNAおよびタンパク質の内在蛍光の測定、配列予測のための計算モデルの統合、ラベルフリークロマチンイメージングの統合にまで及ぶ可能性があります。