Name: 人間の脳組織のためのクロマチンアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法を用いた死後人間脳組織におけるヒストンメチル化マッピングとエピジェネティック制御機構の解析。この手法は正常および疾患脳における遺伝子発現のメカニズム理解に貢献します。

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この作品は、国立精神衛生研究所（5R01MH071476）からの助成金によって支えられて。

手順： 第1回日 1。バッファをDouncingと冷凍事後灰白質組織の50から500 mgをホモジナイズする。 ！注意 - ！ヒト組織は、厳格な安全条件の下で慎重に取り扱う必要があります。それは、BSL - 2以上の安全基準で処理する必要があります。 <ol><li>以前に解剖、検死-80〜脳° C、バッファをDouncingの5倍脳容積でそれらをダウンス、および2.0 mLのマイクロ遠心チューブに行われます。マッチしたサンプルと対照のペアが同時に処理されます。 </li></ol> 2。ミクロコッカスヌクレアーゼ（MN）消化<ol><li>氷の上に配置する前にピペッティングして、ソリューション内のサンプルと混合するミクロコッカスヌクレアーゼの5U/mLを追加。 *重要なステップ- MNが偶数の4で行動する能力を持っているので、すぐにこの手順を実行することが重要℃である</li><li> 37℃で7分間サンプルをインキュベート℃に</li><li> 7分のインキュベーションの後、MNaseの活動を停止するには10mMの濃度に0.5M EDTAを加える。 </li></ol> 3。 Hypotonisation <ol><li> 15 mLのファルコンチューブにサンプルを置きます。 0.2mmのEDTA、0.2Mベンズアミジン及び0.1Mのphenylmethanesulphonylfluorideの1 / 1000のサンプルの量（PMSF）の1 / 2000サンプルの体積の10倍のサンプルボリュームを追加します。後者の二つの化合物は、プロテアーゼ阻害剤として使用されています。 * 重要なステップ-すべての手順の間に氷上でサンプルを維持することが重要です。 </li><li>それは10分ごとにボルテックスしながら、1時間サンプルをインキュベートする。 </li><li>時間長いインキュベーションの終わりに、1 / 2000 3M DTTのサンプルの量、さらに別のプロテアーゼ阻害剤を追加。 </li><li>渦のサンプルは、もう一度、4℃で10分間3175 RCFで遠心 *オプションのステップ-プロテインGアガロースでPrecleansing。 <ol><li>上清を取り出し、新しい15 mLのファルコンチューブに入れ。 </li><li>プロテインGアガロースの500μLを追加します。 </li><li> 30分間室温で回転させます。 </li><li>で10分間4℃で4000rpmで遠心する</li></ol></li><li> 500μLを入力コントロール（のみゲノムDNAを含む）として使用されるように上清を配布し、残りはサンプルごとの1600μLを含む2つのチューブに分割されます - クロマチン免疫沈降（ChIP）サンプル用です。 </li><li>入力コントロールは、さらに使用するまで-80℃CO / Nに配置されます。 </li><li> ChIPサンプルに - して抗体の10XFSBと4μgの1:10体積、渦のサンプルを追加し、4℃で一晩、それらを回転させる。 ！注意 - ！抗体の量と希釈は、最適化が必要な場合があります。 </li></ol>第2日目 ！注意！ -ヌクレオソームDNAを単離するために使用されるプロテインGアガロースを洗浄することによって第2日が始まります 。アガロースビーズは非常に敏感であるので、アガロースビーズを含むソリューションをピペッティングするたびにヒントの頭を切断する必要があります。 1。 DNAにプロテインGアガロースビーズをプロービング<ol><li> 2 mlのマイクロチューブに245μLのプロテインG -アガロース（イナフ4チューブ用）（ループ）に1.6mlの1XFSBを追加。 </li><li> 2つの2 mLチューブと補充1X FSBでそれぞれ最大1.6 mLまでに解決策を区切ります。 </li><li> 30秒間室温で回転させると30秒間に0.1 RCFで遠心。 </li><li>真空を用いて上清を取り除く。 </li><li>もう一度1.6mlの1X FSBを追加。 30秒間のサンプルを回転させ、その後30秒間に0.1 RCFで遠心。 </li><li>再び上清を除き、および1.5 mLの1XFSBで両方のチューブを組み合わせる。 </li><li> 15μLサケ精子DNA（10mg/mL）を追加します。 ！注意 - ！このステップは、原理的には、ビーズの免疫沈降物の非特異的結合を減らす必要があります。しかし、これはまた、（人間の）DNA配列のいくつかの誤検知につながる可能性があります。 </li><li> 30秒間に0.1 RCFで遠心分離し、室温で30分間回転させます。 </li><li>上清を取り除く。 1XFSB 200μLを加える。 </li><li>各ChIPのサンプルにアガロースビーズを90μLを加える。 1時間4℃で回転させる。 </li><li>ネガティブコントロールとして機能し、4で回転℃で1時間に残っているアガロースビーズに1XFSB液1mLを追加。 </li><li>時間の長いインキュベーション後、30秒間に0.1 RCFでサンプルとネガティブコントロールを遠心してください。上清を捨てる。 </li></ol> 2。ビーズを洗浄 ！注意！ -洗浄バッファーは使用まで4℃で保管し、古いか月未満の場合にのみ使用することがありますする必要があります。 <ol><li>ビーズにそれぞれの洗浄溶液1 mLを加え、室温で3分間回転させます。 </li><li> 30秒で0.1 RCFで遠心。 </li><li>上清を使用して真空を捨てる。 </li></ol> *各洗浄液 - 低塩の洗浄バッファー - 高塩分洗浄バッファ</p&gt; -塩化リチウム溶液- わずか1分、室温で回転させる！ - TE緩衝液（10mMトリス、1mMのEDTA液pH = 8） 3。溶出 *重要なステップは -それを使用する必要がある日にすべての実験のために新鮮な溶出バッファーを加えます。 <ol><li>各サンプルに、新たに調製した溶出緩衝液250μLを加える。 </li><li> 1分間に0.4 RCFで遠心分離し、RTで15分間回転させます。 </li><li> 2.0 mlのマイクロ遠心チューブ（ループ）で上清を保存します。 </li><li>数秒間手でそれぞれのサンプルと渦に溶出バッファー250μLを加える。その後、mulitvortexer上で15分間ボルテックスサンプル。 </li><li> 4分間に16 RCF rpmで遠心し、同じ2.0mLのチューブ（ループ）で上清を保存する。 </li></ol> 4。ダイジェストプロテイン<ol><li>各チップのサンプルに10μlの0.5M EDTA、25μlの0.8Mのトリス- HCl、pH6.5で、10 mg / mlのプロテ​​イナーゼK（1 / 200サンプル）を追加します。 </li><li>各入力の制御に、プロテイナーゼK消化（サンプルバッファーの1 / 10）及び10mg/mlプロテイナーゼK（サンプルバッファーの1 / 200）のために溶解バッファーを追加します。 </li><li>少なくとも3時間、52℃での入力とChIPサンプルをインキュベートする。 </li></ol> 5。フェノール/クロロホルム抽出 ！注意 - ！実験はフェノール/クロロホルムを必要とは、フードの下で実行する必要があります。フェノール/クロロホルム処理する際にニトリルの手袋を使用してください。 <ol><li> 3時間のインキュベーションの後、我々は、各サンプルに500μlのフェノールクロロホルムを追加してください。 </li><li>数秒間ボルテックスすべてのサンプルは、その後5分、13 RCFのrpmで遠心。 </li><li>この時点で、2つのフェーズが存在するであろうと我々はトップフェーズの内容に興味を持っています。上部相を取り出し、2 mlのマイクロチューブに入れて。 </li><li> 100％エタノール1.375 mLのと一緒に各サンプルに3M酢酸ナトリウムのグリコーゲンおよび50μLの2μlの混合物を追加。 </li><li>激しくボルテックスし、すべてのサンプル。 ℃で一晩-80に配置します。 </li></ol> 3日目<ol><li>削除するサンプルフォーム-80 ° Cとそれらを解凍するために氷の上に置きます。 </li><li> 4時10分15 RCFで遠心分離℃に</li><li>慎重にチューブの底にペレットが剥がれないように上清を取り除く。 </li><li>各サンプルに冷75％エタノール1 mlを追加し、次にそれらを4-6回転倒混和します。 </li><li> 4℃で5分間18 RCFで遠心℃、 </li><li>もう一度上清を除去し、ペレットを空気乾燥することができます。 </li><li> -80 50 4mmのトリス- HCl、PH8のμLとストアに乾燥ペレットを溶解℃でさらに使用するまで。 </li></ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

プロトコルは、これらのクロマチンのマーキングは、（ヒストン）アセチル化とリン酸化1を含む変更の他のタイプと比較して、死後のアーチファクトが発生しにくくなる可能性があるため、人間の脳のヒストンおよび/ ​​またはDNAメチル化の署名に興味がある研究者のために特に有用であるここで概要を説明2。死後脳では、モノヌクレオソームの調製の研究に適している、DNAは、少なくとも範囲で一般的に代表的な自己消化間隔（死亡および凍結/組織の格納の間の時間）と試験体で、主にコアヒストンに接続されたまま1.5日1〜数時間まで。しかし、モノヌクレオソームの調製は、特に遺伝子3の転写開始部位の周囲の配列の周りに、ヌクレオソームの位置と密度の変化に敏感である可能性があります。そのため、変更に依存しない抗ヒストン抗体を用いた対照実験を含める必要があります。また、それは（超遠心分離を含む）追加の精製ステップと組み合わせてミクロコッカスヌクレアーゼダイジェストに短いインキュベーション時間を用いて、人間の脳の抽出物からポリ-ヌクレオソームフラクションを分離することも可能です。最後に、死後脳における結合ゲノム...

ソリューション： <ul><li> nChIP Douncingバッファー：10mMトリス、4 mMのMgCl 2、1mMのCaCl 2は、pHを7.5に調整する</li><li> 10倍FSB：50mMのEDTA、200mMのトリス、500mMのNaClは、pHを7.5に調整する</li><li>低塩洗浄緩衝液：0.1％SDS、1％トリトンX - 100、2mMのEDTA、20mMトリス（pH 8）を、150mMのNaCl </li><li>高い塩洗浄緩衝液：0.1％SDS、1％トリトンX - 100、2mMのEDTA、20mMトリス（pHを8）、500mMのNaCl </li><li>塩化リチウム緩衝液：1％IGEPAL - CA 630、1％デオキシコール酸、1mMのEDTA（pH8）に、10mMのトリス（pH8）に、0.25 M塩化リチウム</li><li> TEバッファー：10mMトリス（pHを8）、1mMのEDTA </li><li>溶出バッファー：0.1M NaHCO 3を 、1％SDS </li><li>プロテイナーゼK消化バッファー（10X）：1Mトリス、50mMのEDTA、2％SDS、2M NaClを8.0にpHを調整する</li><li> 3 M酢酸ナトリウム：オートクレーブ滅菌蒸留水100mLで24.61グラム無水酢酸ナトリウム（MW = 82.03）。濃縮された酢酸を用いて5.2にpHを調整する。 </li></ul>

人間の脳組織のためのクロマチンアッセイ

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

このような統合失調症、双極性疾患や自閉症などの慢性神経精神疾患は、遺伝子発現と他の分子病理学のエピジェネティックな変化を引き起こす可能性がある遺伝的要因と環境要因の組み合わせに起因すると考えられています。伝統的に、しかし、死後脳での発現の研究​​は、mRNAやタンパク質の定量化に限られていた。そのような自己消化時間や組織の健全性のばらつきなどの死後脳研究で遭遇する制限はまたより高次のクロマチン構造のいずれかの研究に影響を与える可能性があります。しかし、DNAを含むゲノムDNAのヌクレオソームの組織：結合コアヒストンは - 主に様々な脳の銀行が提供する代表的なサンプルで保存されるように見えます。そのため、死後脳で定義されたゲノムの遺伝子座でのメチル化パターンとコアヒストンの他の共有結合修飾を研究することが可能です。ここで、我々は凍結（固定なし）人間の脳の標本用に簡略化したネイティブクロマチン免疫沈降（NChIP）プロトコルを提示する。脳ホモジネートのミクロコッカスヌクレアーゼの消化から始まる、NChIPは、3日以内に完了することができる定量PCRが続きます。ここで紹介する方法は、通常と病気のヒトの脳における遺伝子発現のエピジェネティックな機構を解明するために有用なはずです。

最近まで、人間の脳での発現の研究​​は、RNAやタンパク質の定量化に限られていた。このホワイトペーパーで説明されているクロマチン免疫沈降の技術と、それは死後脳における遺伝子発現のヒストンメチル化と他のエピジェネティックな調節因子をマッピングすることが可能となります。

統合失調症、双極性障害、自閉症などの慢性の神経精神疾患は、遺伝的要因と環境的要因の組み合わせによって生じると考えられています。

こんにちは、私はUMassメディカルスクールの精神医学科にあるDr.Sha Mc Barianの研究室のAmish Matanです。本日は、死後ヒト脳組織を用いたクロマチン免疫沈降の手順について解説します。以下の手順はそれほど複雑ではありません。最も刺激的なのは、最近までヒト脳における発現解析が、mRNAとタンパク質の単純な定量にとどまっていたことです。この手法を用いることで、正常および疾患状態にあるヒト脳における遺伝子発現のメカニズム的な基盤について、より深い理解が得られるでしょう。それでは、クロマチンの免疫共沈殿を開始しましょう。あらかじめ凍結保存された死後ヒト脳組織から切片を作成し、使用しました。安全ゴーグルを着用し、ヒト組織の取り扱い用に指定された区域で作業することが重要です。これらのサンプルの処理において、脳組織は脳体積の5倍量のdown sink bufferで希釈されます。すべての組織が溶液内で均質になったと思われるところで、組織を2 mLチューブに移します。組織の均質化後、サンプルに5 units/mLのMicrococcal Nucleaseを加え、ピペッティングによって溶液を混ぜ合わせます。その後、氷上に置きます。この工程を迅速に行うことが重要です。Micrococcal nucleaseは4 °Cであっても作用する能力があるためです。すべてのサンプルにMicrococcal nucleaseで処理を施した後、速やかに37 °Cのウォーターバスに移し、サンプルを7分間インキュベートします。7分間のインキュベーション後、0.5 MのEDTAを最終濃度10 mMになるように加え、マイクロコッカスヌクレアーゼ活性を停止させます。これで、精製ステップに進む準備が整いました。マイクロコッカスヌクレアーゼで処理し、ヌクレオソームDNAを含むサンプルを準備した後、精製を開始します。Navaが15 mLのFalconチューブを用意し、そこに0.2 mMのEDTAを4.5 mL、0.2 Mのβ-mercaptoethanolを2.5 µL、および0.1 MのPMSFを4.5 µL加えます。そこにサンプルを移します。次に、10分ごとにボルテックスしながら、サンプルを氷上で1時間インキュベートします。1時間のインキュベーション後、3 MのDTTを2.5 µL添加します。サンプルを再度ボルテックスし、次いでスイングバケットローターを用いて4°C、3,175 RCFで10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を分注し、500 µLをゲノムDNAのみを含むインプットコントロールとして使用し、残りを1,600 µLずつ2本のチューブに分けます。これがクロマチン免疫共沈降サンプルとなります。入力コントロールは、次回の使用まで-80°Cで一晩保存します。次に、サンプルの10分の1量に相当する160 µLの10 XFSBを添加します。同時に、4 µgの抗体を添加します。次にサンプルをボルテックスし、4 °Cで一晩回転混和させます。一晩のインキュベーション後、ヌクレオソームDNAの単離に使用するプロテインGビーズを洗浄します。これらのアガロースビーズは非常に繊細であるため、操作時にはピペットチップの先端をカットする必要があります。これは、ピペッティング時にビーズの十分なスペースを確保するためです。次に、1.6 mLの1X FSビーズを、245 µLのプロテインジャガーと共に2 mLマイクロ遠心チューブに加えます。これで、4本分のサンプルチューブに十分な量になります。次に、ビーズ溶液を2本の2 mLチューブに分注し、それぞれに1 XFSBを加えて1.6 mLまで満たします。室温でローテーターを用いて30秒間回転させた後、0.1 RCFで30秒間遠心分離します。遠心分離後、真空吸引を用いてATEを除去します。1X FSBを1.6 mL加えます。再度、サンプルのチューブをローテーターで30秒間回転させ、その後、0.1 RCFで30秒間再び遠心分離します。遠心分離後、上清を再度取り除き、両方のチューブを1.5 mLの1X FSBでまとめます。さらに、15 µLの精子DNAを加えます。室温で30分間回転混和させた後、0.1 RCFで30秒間遠心分離します。上清を除去し、200 µLの1×FSBを加えます。次に、各クロマチン沈殿サンプルにagro speedsを90 µL加え、4°Cで1時間回転混和させます。陰性対照として、残りのagro speedsに1 XFSBを1 mL加え、クロマチン免疫沈降サンプルとともに4°Cで1時間回転混和させます。この1時間のインキュベーションの間に、新鮮な溶解バッファーを調製します。これは、1時間のインキュベーションの後、実験の後半で使用されます。サンプルとネガティブコントロールを 0.1 CFS で 30 秒間遠心分離し、上清を捨てます。次に、低塩洗浄バッファー、高塩洗浄バッファー、塩化リチウム溶液、そして最後に pH 8 の TE バッファーという、4 種類の異なる洗浄溶液でビーズを洗浄します。塩化リチウム溶液を除く各バッファーについて、サンプルを室温で3分間回転させ、その後0.1 R Csで30秒間遠心分離します。塩化リチウムによる洗浄では、サンプルを室温で1分間のみ回転させます。各洗浄後、吸引機を用いて上清を廃棄します。それでは、サンプルの溶出に進みます。溶出ステップを開始するために、各サンプルに新しく調製した溶出バッファーを250 µL加えます。室温で15分間サンプルを回転させた後、0.4 RCFで1分間遠心分離します。次に、上清を2 mLのオレンジ色チューブに回収します。その後、各サンプルに250 µLの溶出バッファーを加えます。再度、すべてを手動で数秒間ボルテックスします。その後、サンプルを15分間ボルテックスし、さらに15分間ボルテックスした後、チューブを遠心分離機にかけます。16 RCFで4分間遠心分離し、上清を同じ2 mLマイクロチューブに回収します。サンプル中のタンパク質を消化するため、まず各クロマチン免疫沈降サンプルに、10 µLの0.5 M DTT、25 µLのpH 6.5の0.8 M Tris-HCl、および2.5 µLの10 mg/mL Proteinase Kを加えます。各入力コントロールに、15 µLの溶解バッファーと2.5 µLの10 mg/mL Proteinase Kを添加します。入力サンプルとクロマチン免疫沈降サンプルの両方を52 °Cで少なくとも3時間インキュベートします。3時間のインキュベーションが完了したので、フェノール・クロロホルム抽出を開始します。3時間のインキュベーション後、各サンプルに500 µLのフェニルクロロフォルムを加えます。フェニルクロロフォルムは、皮膚への接触および吸入の両方において有害な有機化学物質であるため、この操作はドラフトチャンバー内で行います。次に、すべてのサンプルを数秒間ボルテックスし、13 RCFで5分間遠心分離します。チューブ内には2つの相が生じているはずです。上層の内容を回収するため、上層を分取し、2 mLのマイクロ遠心チューブに移します。次に、2 µLのグリコーゲンと50 µLの3 M酢酸ナトリウムの混合液を、1.375 mLの100%エタノールと共に各サンプルに加えます。すべてのサンプルを激しくボルテックスし、-80 °Cで一晩保存します。一晩のインキュベーション後、サンプルを氷上に置いて解凍します。その後、4 °C、15 RCFで10分間、高速遠心分離を行います。遠心分離後、チューブ底部のペレットを乱さないように注意して上清を除去します。次に、各サンプルに冷えた75% ethanolを1 mL加え、すべて4〜6回転倒混和します。その後、チューブを4°C、18 RCFで5分間、再度遠心分離します。上清を再度除去し、ペレットを風乾させます。ペレットが乾燥したら、pH 8の4 mM trace HCl 50 µLに溶解し、-80 °Cで保存します。これで、凍結したヒト死後脳組織を用いたクロマチン免疫沈降法の手順について説明しました。そして、この手順を行う際は、ヒト脳組織を扱う上で必要なあらゆる予防策を講じることが重要であることを忘れないでください。クロマチン免疫共沈降アッセイを用いることで、正常および疾患状態にあるヒト脳における遺伝子発現への理解をさらに深めることができます。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

Research

JoVE Journal

Biology

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出典:Mendez, F. M. et al., Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp.

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