人間の脳組織のためのクロマチンアッセイ

こんにちは、私はUMassメディカルスクールの精神医学科にあるDr.Sha Mc Barianの研究室のAmish Matanです。本日は、死後ヒト脳組織を用いたクロマチン免疫沈降の手順について解説します。以下の手順はそれほど複雑ではありません。

最も刺激的なのは、最近までヒト脳における発現解析が、mRNAとタンパク質の単純な定量にとどまっていたことです。この手法を用いることで、正常および疾患状態にあるヒト脳における遺伝子発現のメカニズム的な基盤について、より深い理解が得られるでしょう。それでは、クロマチンの免疫共沈殿を開始しましょう。

あらかじめ凍結保存された死後ヒト脳組織から切片を作成し、使用しました。安全ゴーグルを着用し、ヒト組織の取り扱い用に指定された区域で作業することが重要です。これらのサンプルの処理において、脳組織は脳体積の5倍量のdown sink bufferで希釈されます。

すべての組織が溶液内で均質になったと思われるところで、組織を2 mLチューブに移します。組織の均質化後、サンプルに5 units/mLのMicrococcal Nucleaseを加え、ピペッティングによって溶液を混ぜ合わせます。その後、氷上に置きます。

この工程を迅速に行うことが重要です。Micrococcal nucleaseは4 °Cであっても作用する能力があるためです。すべてのサンプルにMicrococcal nucleaseで処理を施した後、速やかに37 °Cのウォーターバスに移し、サンプルを7分間インキュベートします。

7分間のインキュベーション後、0.5 MのEDTAを最終濃度10 mMになるように加え、マイクロコッカスヌクレアーゼ活性を停止させます。これで、精製ステップに進む準備が整いました。マイクロコッカスヌクレアーゼで処理し、ヌクレオソームDNAを含むサンプルを準備した後、精製を開始します。

Navaが15 mLのFalconチューブを用意し、そこに0.2 mMのEDTAを4.5 mL、0.2 Mのβ-mercaptoethanolを2.5 µL、および0.1 MのPMSFを4.5 µL加えます。そこにサンプルを移します。次に、10分ごとにボルテックスしながら、サンプルを氷上で1時間インキュベートします。

1時間のインキュベーション後、3 MのDTTを2.5 µL添加します。サンプルを再度ボルテックスし、次いでスイングバケットローターを用いて4°C、3,175 RCFで10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を分注し、500 µLをゲノムDNAのみを含むインプットコントロールとして使用し、残りを1,600 µLずつ2本のチューブに分けます。これがクロマチン免疫共沈降サンプルとなります。

入力コントロールは、次回の使用まで-80°Cで一晩保存します。次に、サンプルの10分の1量に相当する160 µLの10 XFSBを添加します。同時に、4 µgの抗体を添加します。

次にサンプルをボルテックスし、4 °Cで一晩回転混和させます。一晩のインキュベーション後、ヌクレオソームDNAの単離に使用するプロテインGビーズを洗浄します。これらのアガロースビーズは非常に繊細であるため、操作時にはピペットチップの先端をカットする必要があります。

これは、ピペッティング時にビーズの十分なスペースを確保するためです。次に、1.6 mLの1X FSビーズを、245 µLのプロテインジャガーと共に2 mLマイクロ遠心チューブに加えます。これで、4本分のサンプルチューブに十分な量になります。

次に、ビーズ溶液を2本の2 mLチューブに分注し、それぞれに1 XFSBを加えて1.6 mLまで満たします。室温でローテーターを用いて30秒間回転させた後、0.1 RCFで30秒間遠心分離します。遠心分離後、真空吸引を用いてATEを除去します。

1X FSBを1.6 mL加えます。再度、サンプルのチューブをローテーターで30秒間回転させ、その後、0.1 RCFで30秒間再び遠心分離します。遠心分離後、上清を再度取り除き、両方のチューブを1.5 mLの1X FSBでまとめます。

さらに、15 µLの精子DNAを加えます。室温で30分間回転混和させた後、0.1 RCFで30秒間遠心分離します。上清を除去し、200 µLの1×FSBを加えます。

次に、各クロマチン沈殿サンプルにagro speedsを90 µL加え、4°Cで1時間回転混和させます。陰性対照として、残りのagro speedsに1 XFSBを1 mL加え、クロマチン免疫沈降サンプルとともに4°Cで1時間回転混和させます。この1時間のインキュベーションの間に、新鮮な溶解バッファーを調製します。

これは、1時間のインキュベーションの後、実験の後半で使用されます。サンプルとネガティブコントロールを 0.1 CFS で 30 秒間遠心分離し、上清を捨てます。次に、低塩洗浄バッファー、高塩洗浄バッファー、塩化リチウム溶液、そして最後に pH 8 の TE バッファーという、4 種類の異なる洗浄溶液でビーズを洗浄します。

塩化リチウム溶液を除く各バッファーについて、サンプルを室温で3分間回転させ、その後0.1 R Csで30秒間遠心分離します。塩化リチウムによる洗浄では、サンプルを室温で1分間のみ回転させます。各洗浄後、吸引機を用いて上清を廃棄します。

それでは、サンプルの溶出に進みます。溶出ステップを開始するために、各サンプルに新しく調製した溶出バッファーを250 µL加えます。室温で15分間サンプルを回転させた後、0.4 RCFで1分間遠心分離します。

次に、上清を2 mLのオレンジ色チューブに回収します。その後、各サンプルに250 µLの溶出バッファーを加えます。再度、すべてを手動で数秒間ボルテックスします。

その後、サンプルを15分間ボルテックスし、さらに15分間ボルテックスした後、チューブを遠心分離機にかけます。16 RCFで4分間遠心分離し、上清を同じ2 mLマイクロチューブに回収します。サンプル中のタンパク質を消化するため、まず各クロマチン免疫沈降サンプルに、10 µLの0.5 M DTT、25 µLのpH 6.5の0.8 M Tris-HCl、および2.5 µLの10 mg/mL Proteinase Kを加えます。

各入力コントロールに、15 µLの溶解バッファーと2.5 µLの10 mg/mL Proteinase Kを添加します。入力サンプルとクロマチン免疫沈降サンプルの両方を52 °Cで少なくとも3時間インキュベートします。3時間のインキュベーションが完了したので、フェノール・クロロホルム抽出を開始します。

3時間のインキュベーション後、各サンプルに500 µLのフェニルクロロフォルムを加えます。フェニルクロロフォルムは、皮膚への接触および吸入の両方において有害な有機化学物質であるため、この操作はドラフトチャンバー内で行います。次に、すべてのサンプルを数秒間ボルテックスし、13 RCFで5分間遠心分離します。

チューブ内には2つの相が生じているはずです。上層の内容を回収するため、上層を分取し、2 mLのマイクロ遠心チューブに移します。次に、2 µLのグリコーゲンと50 µLの3 M酢酸ナトリウムの混合液を、1.375 mLの100%エタノールと共に各サンプルに加えます。

すべてのサンプルを激しくボルテックスし、-80 °Cで一晩保存します。一晩のインキュベーション後、サンプルを氷上に置いて解凍します。その後、4 °C、15 RCFで10分間、高速遠心分離を行います。

遠心分離後、チューブ底部のペレットを乱さないように注意して上清を除去します。次に、各サンプルに冷えた75% ethanolを1 mL加え、すべて4〜6回転倒混和します。その後、チューブを4°C、18 RCFで5分間、再度遠心分離します。

上清を再度除去し、ペレットを風乾させます。ペレットが乾燥したら、pH 8の4 mM trace HCl 50 µLに溶解し、-80 °Cで保存します。これで、凍結したヒト死後脳組織を用いたクロマチン免疫沈降法の手順について説明しました。

そして、この手順を行う際は、ヒト脳組織を扱う上で必要なあらゆる予防策を講じることが重要であることを忘れないでください。クロマチン免疫共沈降アッセイを用いることで、正常および疾患状態にあるヒト脳における遺伝子発現への理解をさらに深めることができます。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。