Name: 免疫ペルオキシダーゼアッセイを用いたヒトコロナウイルスの滴定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学ぶ免疫ペルオキシダーゼアッセイによるヒトコロナウイルスの滴定法。 plaque assayでは検出困難な細胞障害効果を示さないウイルスを正確に定量し、ウイルス学・免疫学研究の精度向上に貢献します。

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この実験的なアプローチのための完全なテキストのプロトコルがで可能です<a href="http://www.springerprotocols.com/">シュプリンガープロトコル</a> 。

著者に開示すべき利益相反はありません。

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

免疫ペルオキシダーゼアッセイを用いたヒトコロナウイルスの滴定

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

感染性ウイルス力価の計算は、ウイルス学者のための基本と本質的な実験的なアプローチを表しています。古典的なプラークアッセイは、ヒトコロナウイルスの株229EとOC43（HCOV）の場合がそうですが、重要な細胞変性効果を、発生しないウイルスには使用できません。別の間接免疫ペルオキシダーゼアッセイ（IPA）がここにこれらのウイルスの検出と滴定のために説明されています。感受性細胞を96ウェルプレート中のサンプルのシリアル対数希釈で接種されています。ウイルス増殖の後、IPAによるウイルスの検出は、&quot;組織培養感染量&quot;（TCID50）として表される感染性ウイルスの力価を、得られます。これは、複製ウイルスが含まれている実験室の井戸の一連のどの半分でウイルス含有試料の希釈を表しています。この手法は、生体試料中のHCOVの滴定（細胞、組織または体液）のための信頼性の高い方法です。

このビデオでは、我々は、免疫アッセイとして知られている酵素抗原の検出技術を使用して、ウイルスの検出とタイターのための代替方法を示しています。ここで、我々は、あなたのウイルスのサンプルを収集する方法を示して、テスト用のセルを準備し、最終的にウイルス力価を決定するために希釈系列を用いて免疫アッセイになります。

感染性ウイルスタイターの測定は、ウイルス学者にとって基本的かつ不可欠な実験的アプローチである。古典的なプラークアッセイは、…には使用できない。

感染性ウイルスタイターの算出は、基本的な実験手法です。しかし、プラークアッセイを用いる従来の手法は、ヒトコロナウイルスのように細胞変性効果（cytopathic effects）を示さないウイルスに対しては、最も信頼性の高い方法とは言えません。本ビデオでは、免疫ペルオキシダーゼ法として知られる酵素的抗原検出技術を用いて、ウイルスの検出およびタイター測定を行う代替手法を実演します。ここでは、ウイルスサンプルの採取方法、検査のための細胞調製、そして最終的に、連続希釈を用いた免疫ペルオキシダーゼ法によるウイルスタイターの測定方法について説明します。こんにちは。私はカナダのケベック州ラバルにあるAM RIP研究所の神経免疫学研究室のディレクター、Pierre Albo博士です。本日は、培養においてプラークを形成しないこれらのウイルスのプロトタイプ株である、ヒトコロナウイルス株OT 43および29Eの定量方法を実演します。そこで、この問題を解決するためのアッセイを開発しました。これは免疫ペルオキシダーゼ法と呼ばれています。このプロトコルを実演するため、私の学生であるGabrielle Marol、技術者のFrancis Nader、そして研究員であるEllan Jacobを紹介します。それでは始めていきましょう。まず、組織サンプルの調製を行います。各臓器の採取に使用する滅菌チューブの重量をあらかじめ測定することから始めます。空チューブそれぞれの重量を測定した後、滅菌条件下で目的の臓器を迅速に摘出し、氷上に保持します。各摘出の間には、器具を70% ethanolで洗浄することが重要です。臓器の回収後、各生体サンプルの重量を測定します。次に、ラミナーフローフード内でポリトロンホモジナイザーを用い、10%滅菌PBSで組織サンプルをホモジナイズします。ホモジナイザーのスイッチを入れ、チューブを上下に動かして組織を分散させます。各サンプルのホモジナイズ後、次の組織サンプルを処理する前に、装置を滅菌水で1回、70%エタノールで1回、最後にPBSで1回洗浄してください。サンプルのホモジナイズ後、チューブを4 °Cで20分間遠心分離します。1000 Gsで遠心し、上清を新しい滅菌チューブに回収します。この時点で、ウイルスサンプルを免疫ペルオキシダーゼ検出用に処理することが可能です。あるいは、直ちに-80°Cで凍結し、アッセイの準備が整うまで保存することも可能です。次に、細胞サンプルの調製を行います。接着細胞と浮遊細胞では調製方法が異なりますが、いずれの場合も細胞内および細胞外のウイルス力価の回収が行われます。接着細胞における細胞外ウイルス産生量を決定するために、感染後適切なタイミングで、感染細胞から上清を回収し、滅菌チューブに保存して検査に供します。細胞内ウイルスタイターを推定する場合、まず培地を除去し、温めた滅菌PBSで細胞を洗浄します。その後、同量または規定量の培地を加え、-80°Cでの凍結融解サイクルを3回行います。これにより細胞が溶解し、ウイルス粒子が培地中に放出されます。浮遊細胞の場合、まず細胞を1,000 ×gで5分間遠心分離します。細胞をペレット化した後、上清を滅菌チューブに回収します。これが感染性ウイルスの細胞外画分となります。次に、回収した上清と同量、または既知量の培地で細胞ペレットを懸濁します。その後、-80 °C での凍結融解サイクルを3回行い、細胞を溶解させて培地中にウイルス粒子を放出させます。これが感染性ウイルスの細胞内分画となります。接着細胞または浮遊細胞を溶解した後、1,000 ×gで5分間遠心分離します。その後、上清を新しい滅菌チューブに回収し、免疫ペルオキシダーゼ法を用いてタイターを分析します。また、サンプルを直ちに-80 °Cで凍結し、分析まで保存することも可能です。生物学的試料におけるヒトコロナウイルス感染の産生性を検証するため、コロナウイルス感受性細胞を用いて免疫ペルオキシダーゼアッセイを行います。まず、コンフルエントな単層から感受性細胞の懸濁液を作成するために、トリプシン処理を行います。ヒトコロナウイルスを扱う際、2 29 EL 1 32細胞を感受性細胞として使用し、ヒトコロナウイルス OC 43については、感受性細胞の懸濁液を作成した後にHRT 18細胞株を使用します。これらを組織培養用96ウェルプレートに播種します。マルチチャンネルピペットを使用する場合は、適切な細胞濃度で調整した細胞懸濁液を1ウェルあたり100 µLずつ分注します。1ウェルあたりの感受性細胞数は、使用する細胞の種類および細胞播種を行うタイミングによって異なります。播種後の詳細な手順については、Springerのプロトコルをご参照ください。免疫ペルオキシダーゼアッセイを開始する前に、感受性細胞を先に調製したサンプルで感染させる必要があります。感受性細胞が70～80%のコンフルエンシーに達したら、96ウェルプレートを滅菌ティッシュペーパーで包み、別の滅菌ペーパーの上にプレートを伏せて軽く弾き、各ウェルから培地を除去します。次に、各ウェルに1% FBSを添加した$\alpha$-MEMを100 $\mu$Lずつ加えます。各サンプルは4つの隣接するカラムでテストしてください。同一プレートの第1行の各ウェルに、テストする分注液を100 µLずつ分注します。通常、感受性細胞に感染サンプルの対数段階希釈液を接種します。これを行うには、同じサンプルをさらに4つのウェルに、1ウェルあたり11 µLずつ加えます。次に、96ウェルプレートの2行目において、マルチチャンネルピペットで3回ピペッティング（吸い上げと吐き出し）を行い混合し、各ウェルから11 µLを3行目に移します。これをプレートの最終行まで同様に繰り返します。細胞に接種した後、ヒトコロナウイルスの場合は、5%CO2を含む33 °Cの加湿チャンバー内でプレートをインキュベートします。2290感染細胞を5日間、ヒトコロナウイルス OC43感染細胞を4日間インキュベートします。その後、ウイルス検出へと進みます。インキュベーション後、ウイルスの検出を行います。まず、培地を完全に除去します。ラミナーフローフード内で、プレートを滅菌されていないペーパータオルに叩きつけることで除去します。次に、マルチチャンネルピペットを用いてウェルにPBSを静かに満たし、細胞を慎重に洗浄します。ウェルからPBSを弾き飛ばして除去し、プレート全体をペーパータオルで包んで、残ったPBSを吸い取ります。細胞の洗浄後、0.3%過酸化水素を含む100%メタノールで固定します。メタノール混合液を細胞に加え、室温で15～30分間静置してください。30分間のインキュベーション後、プレートをシンクに向けて振ることで固定液を除去します。残った固定液は、ベンチトップに敷いた数枚のペーパータオルの上にプレートを伏せて振ることで取り除きます。その後、細胞を乾燥させるため、表面を上にして約15～30分間完全に自然乾燥させます。その間に、PBSを用いて適切な希釈倍率でウイルス特異的抗体溶液を調製します。次に、各ウェルにウイルス特異的抗体を100 µL加え、37 °Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートをシンクに向けて軽く叩き、培地を完全に除きます。ウェルにPBSを満たしてプレートを洗浄します。その後、プレートをシンクに向けて軽く叩いて排出し、PBSで洗浄します。さらに2回繰り返します。ベンチトップに敷いた非滅菌のペーパータオルに向けてプレートを伏せて弾き、残留しているPBSをすべて除去します。次に、1:1000に希釈した二次抗体100 µLを各ウェルに加えます。PBSで希釈し、プレートを37°Cで2時間インキュベートします。インキュベーション終了の30分前に、PBSと0.01%過酸化水素の混合物であるDAB検出試薬を調製します。前述と同様に、プレートをPBSで3回洗浄します。プレートを洗浄した後、各ウェルに発色試薬を 100 µL 加えます。室温で 10 ～ 20 分間、または陽性コントロールが染色されるまでインキュベートします。反応を停止させるため、PBS で行ったときと同様にプレートを水で一度洗浄し、各ウェルに脱イオン水を 100 µL 満たします。最後に、光学顕微鏡でプレートを観察し、染色された細胞が見られるすべてのウェルを定量します。これでようやく、ウイルスのタイターを決定することができます。これはcar法を用いて算出でき、その計算式はこのビデオに付随するSpringerプロトコルでご確認いただけます。以上の手順で、ヒトコロナウイルスのタイター測定方法について説明しました。2種類のウイルスを含む試料を扱うこと、および無菌条件下で作業することが重要である点に注意してください。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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