Name: 2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-09T16:32:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 学ぶマウス骨髄由来樹状細胞の培養法と2光子イメージングを用いた免疫応答の可視化。抗原提示細胞の成熟過程とT細胞との相互作用をリアルタイムで観察する手法を解説。

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健康Kirchsteinフェローシップ博士号を取得する前のフェローシップAI - 64128（MPM）、GM - 41514（MDC）、GM - 48071（IP）の国立研究所

1）1つのマウスから、両方の大腿骨の骨を削除します。 <ol><li>筋肉を切り取ると、関節の上下の大腿骨（膝と腰を）公開する解剖鋏を使用してください。解剖ピンセットで大腿骨の中央をつかみ、可能な限りそのまま骨端を残すために、上記と関節の下にカット。 </li><li>小さな解剖鋏を使用して、できるだけ多くの筋肉のように拭き取ります。 RPMIの皿に大腿骨を移す。 </li><li>全ての手順は、滅菌媒体、楽器、ピペットチップと培養皿を使用して、この時点からフードの中で行われるべきである。 </li></ol> 2）大腿骨の滅菌： <ol><li>フードの中で、氷上で70％エタノールで満たされた小さな培養皿にRPMIから骨を転送する。 </li><li>骨は氷上で5分間エタノールに浸して許可する。 </li></ol> 3）無菌条件下で骨髄を収集します。 <ol><li>滅菌濾過したプライマリDCの培養培地を含む小さな培養皿に骨を移す。 </li><li>滅菌ピンセットで、廃棄ディッシュやチューブを介して骨を保持し、滅菌済みのハサミで、（骨の前端）各epiphesisを断つ。カットは、骨の中央部に明るい赤色になって骨髄を公開する必要があります。 </li><li>滅菌シリンジ（26-28ゲージの針）で、滅菌媒体の約100-200 mLを吸い上げる。 </li><li>滅菌媒体の新鮮な料理以上の滅菌ピンセットで骨を持ち、骨の片側に針を挿入する。骨の上部付近に針の先端を置き、徐々に滅菌メディアで骨を洗う。あなたが骨の中心にある場合、針は簡単にスライドするはずです。 </li><li>骨髄は、小さな断片にまたは一体としてのいずれか、洗う。それは骨のと滅菌媒体の皿に出フラッシュされるべきである。 </li><li>完全に骨から骨髄を洗い流すために、必要に応じてこの手順を繰り返します。 </li><li>骨がきれいになると、それは白と透明になります。 </li><li>他の大腿骨では、この手順を繰り返します。それがきれいになると、それぞれの大腿骨を捨てる。 </li></ol> 4）再度中断し、骨髄細胞をスピンダウンする。 <ol><li>滅菌ファルコンチューブに細胞を移す。 </li><li>骨髄はまだ変更されていない場合は、非常に穏やかに単一の細胞懸濁液中に骨髄を分割するために、皿の中で上下にメディアをピペット。これには数分かかる場合がありますし、薄手の力で細胞を殺すことを避けるために徐々に行う必要があります。 </li><li>あなたが他の哺乳動物細胞と同じように細胞を遠心分離します。 </li></ol> 5）細胞の溶解： <ol><li>スピンが行われた後遠心機からチューブを外し、ボンネットの小さな廃棄物（50mlファルコンチューブ）に（別の容器に移す）メディアをオフに注ぐ。 </li><li>優しくチューブの底をフリックでペレットを再懸濁します。 </li><li>滅菌濾過した水と10倍DPBSまたは10倍PBSを使用して、次のボリュームを使用して赤血球（RBC）を除去する水の溶解を行う。 <ul><li> 900mLの滅菌ろ過された水</li><li> 100mLの10倍DPBSまたは10倍のPBS </li></ul></li><li>水を加えた後に10倍PBS 5〜10秒の100 mLを加え。それはすぐにこれだけの赤血球が溶解​​されていることをこれを行う非常に重要です。それは満たされたと準備ピペットの両方を持つことは良い考えです。 </li><li>滅菌DC基本的なメディアの10mLの - 5 mLを追加します。 </li></ol> 6）セルを数える： <ol><li>フードの中で、静かにわずかな反転、45度のチルト（メディアは、チューブの上部に触れるしないように）でチューブを渦巻くことで骨髄細胞の6から11 mLを混ぜる</li><li>カウント用滅菌チューブに、メディアの10mLを削除します。 </li><li>再キャップ細胞、再度遠心する。 </li></ol> 7）めっきの樹状細胞： <ol><li>細胞は、1 × 106/mLの密度でプレートしてください。 </li><li>メッキのプライマリDCのメディアの適切な量で遠心から細胞、デカンテーションメディアと再サスペンドセルを削除します。 </li><li>組織培養インキュベーター内の場所。 </li></ol> 8）文化のケアと熟成。 常により多くのメディアを追加したり、実験に使用する前に、文化を確認してください。細胞の一般的な健康状態をチェックし、潜在的な汚染を探します。 0日目：樹状細胞はメッキ。 3日目：メディアと非adherant細胞の75％を削除し、バックプライマリDCのメディアを追加。 6日目：初期細胞のプレーティング後：次の手順を使用して再板細胞： <ol><li> （あなたが接着細胞が乾燥しないようにする）は非常にわずかに湿ったプレートを残して、滅菌50mlファルコンチューブにいくつかの非adherantこの時点で樹状細胞、および場所が含まれているはずのメディアを、削除する</li><li>各プレートにPBSで3 mMのEDTAを追加し、5分間静置することができます。 </li><li> 45度の角度でプレートを持ち、優しく穏やかに非adherant細胞を取り除くために、プレートの底部に対して上下メディアをピペット。 </li><li> EDTA / PBSが厚いことを示す細胞がの底から収集されているとなるべきプレート。 </li><li>この数分後、細胞の混合物を50 mlのFalconチューブに転送することができます。 </li><li>各プレートごとにこの手順を実行した後にすべてのセルを回転させる。 </li><li>カウントとプレート新しい滅菌10cmの培養皿で二次DCのメディアでプレートあたり1の密度で細胞× 10 ^ 6。組織培養インキュベーターにセルを返します。 </li></ol> DAY 10月11日刺激/抗原負荷の準備ができて成熟DC。 9）樹状細胞刺激のため： <ol><li>活性化とペプチドのローディングのための所望のペプチドとの組み合わせでLPS（lipopolyscaccharide）を使用してください。 LPSの、ソースに応じて、異なる刺激の条件がより良い結果を与える可能性があります。さらに、DCのプレゼンテーションのためのペプチドの所望の量を最適化する必要があります。このプロトコルの刺激条件は100 ng / mLのLPSおよび100 ug / mlとOVA（卵白アルブミン）であった。 </li><li>負荷の抗原は、/使用/収穫前に18〜24時間LPSで扱う。 </li></ol>樹状細胞メディア：すべてのものが追加された後に滅菌済みフィルター異なる樹状細胞の培養条件の見直しのため、結果樹状細胞の表現型のディスカッションセクションを参照してください。これらの培養条件は、効率的にその所属リンパ節へ急速に家庭成熟樹状細胞、皮下注射し、抗原を提示した後18〜24時間を生成するように設計されています。 プライマリDCメディア：すべてのものが追加された後に滅菌済みフィルター <ul><li> 500mLのIMDM（500ミリリットル、最終的なボリューム55-60 mLを削除） </li><li> 50mLの熱不活性化FBS </li><li> 200mMのL - Glnの5mLの、2 mMの最終濃度</li><li> 100 IU / mlペニシリンおよび100 mg / mlストレプトマイシン（10,000 IU / mLのペンおよび10,000 mg / mLの連鎖球菌株の5mL）を</li><li> 50μMのB -ミー（14.3 M B - Meの株式は、化学フード中で1:100に希釈、50マイクロモル濃度は、100 mLのメディアあたり35 ulを使用してください） </li><li> 20〜30 ng / mLのGM - CSF </li><li> 100〜400 IU / mLのIL - 4の約10〜40 ng / mLの</li></ul> 成熟*のSecondaryDCメディア 100 ng / mLのTNF -α（プライマリDCのメディアへの追加） * 注 ：GM - CSF + IL - 4は、未成熟樹状細胞を生成する必要があります。 GM - CSFを使用して+ IL4（400 IU / UL）+ TNF -α（100 ug / mlとは）成熟した単球由来樹状細胞に似た細胞が作成されます。成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞と培養液として効率的に抗原を取ることが知られています内因性のTNF - 4間質細胞から遊離している可能性があります。

<ol><li>Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4%2B+T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J Exp Med. 200, 847-856 (2004).</li>
<li>Henrickson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+sensing+of+antigen+dose+governs+interactive+behavior+with+dendritic+cells+and+sets+a+threshold+for+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation.</a> Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).</li>
<li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes%3A+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102, 1753-1763 (2003).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li>
<li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li>
<li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. 3, (2001).</li>
<li>Winzler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+stages+of+mouse+dendritic+cells+in+growth+factor-dependent+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures.</a> J Exp Med. 185, 317-328 (1997).</li>
<li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+maintains+the+viability+of+murine+epidermal+Langerhans+cells+in+culture%2C+but+in+contrast+to+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%2C+without+inducing+their+functional+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation.</a> J Exp Med. 171, 159-171 (1990).</li>
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<li>Wei, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+signals+in+CD4%2B+T+cells+during+early+contacts+with+antigen-bearing+dendritic+cells+in+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node.</a> J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).</li>
<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8%2B+T+cells+to+sites+of+CD4%2B+T+cell-dendritic+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li>
</ol>

樹状細胞は適応免疫応答と日付に特徴づけられる最も効率的な抗原提示細胞の主要なメディエーターである。文学におけるヒトとマウスの樹状細胞培養のための方法は異なる樹状細胞型の開発に影響を与えるために使用されるサイトカインの種類が異なります。特に、GM - CSF、flt3L、IL4、IL13、TNF -αとIFN -γは、成熟未成熟、炎症性および定常状態の試験管3-7に樹状細胞由来のマウス骨髄のように生成するために異なる組み合わせで使用されています。ここで、我々は、抗原を提示し、T細胞をve Naの活性化、皮下注射後にリンパ節を排出するためにホーミングすることのできる成熟したマウスの樹状細胞の生産のための簡単​​な方法を提示する。結果として得られる樹状細胞集団は、通常、LPSの活性化にCD80/86の誘導発現と&gt; 85％CD11chighです。 7日目に培養にTNF -の追加はオプションであり、より成熟したphenotype8を生成します。 体外ランゲルハンス樹状細胞培養でのメンテナンス、TNF -αは、重要な生存因子ですが、9を成熟させる細胞を刺激していません。それは、内因性の源からのTNF -...

2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

マウス樹状細胞の調製のためのいくつかの方法が文献で見つけることができます。ここで、我々は文化の中では85％以上のCD11c高樹状細胞を生成する手法を提案することを皮下注射し、抗原特異的T細胞（ビデオを参照）に存在する抗原を後に流入領域リンパ節へのホーム。さらに、我々は、10日目に、培養細胞の形態は、成熟樹状細胞の典型的であり、細胞の&lt;85％がCD11chighである、樹状細胞の成熟を、追跡するためにエッセン楽器Incucyteを使用してください。 2光子イメージングによる末梢リンパ節における抗原提示の研究では、樹状細胞とT細胞の相互作用1、2の3つのフェーズが存在することを明らかにした。フェーズIは、樹状細胞1、2を運ぶ非常に運動性の抗原特異的T細胞と抗原との間の短いシリアル接点で構成されています。第二段階は、樹状細胞1、2をもつ抗原特異的T細胞と抗原との間の長期にわたる接触によってマークされます。最後に、第III相は、運動性を回復し、1、2を分割し始めて、樹状細胞から切り離すT細胞によって特徴付けられる。これは、抗原負荷細胞トラッカー色素標識樹状細胞の二光子励起イメージングによって解析することができる抗原特異的相互作用のタイプの一例です。

樹状細胞による二次リンパ器官における抗原提示がT細胞媒介免疫応答の開始に重要です。ここでは、マウス樹状細胞を骨髄由来の文化、活性化、および2光子イメージングのための標識を示す。

マウス樹状細胞の調製法については、文献にいくつかの手法が記載されています。ここでは、85%以上の……を産出する方法について提示します。

骨髄からの樹状細胞の調製は、免疫系の2光子イメージングにおけるin vitroまたはin vivo実験に使用可能な抗原提示細胞の優れた供給源となります。抗原提示細胞を導入することで、生体内のリンパ節という環境における抗原特異的な細胞間相互作用の研究が可能になります。本ビデオでは、骨髄の無菌的な単離および成熟樹状細胞を産生するための培養技術について解説します。さらに、1日目から11日目までの樹状細胞の分化過程を追跡します。この分化過程は、静止画およびScent Technologies社のIncuSiteを用いて撮影したインキュベーター内ビデオで示します。最後に、骨髄由来樹状細胞が鏡像リンパ節において、OT-II T細胞にOVA抗原を提示する様子を示します。こんにちは。私はカリフォルニア大学のMicah Halen研究室に所属しているMelanie Matthewです。細胞が成長している間、内部で何が起きているのか不思議に思ったことはありませんか？今日はそれを解説します。本プロトコルの手順として、まず施設内のいくつかの機器の使用方法を説明します。インキュサイト（Incucyte）を使用すると、インキュベーター内で細胞培養の増殖を追跡することができます。このプロトコルでは、マウスから骨髄由来の樹状細胞を単離し、調製する方法を説明します。まず、大腿骨の摘出と骨髄の分離方法について説明します。まず、動物をピンで固定します。次に、動物の体に70% ethanolを塗布します。動物の中央線に沿って、最初の切開を行います。次に、ここでお見せしているように脚の内側を切断します。大腿骨の上の筋肉組織を露出させるため、筋肉を脇に寄せ、解剖用ピンセットで大きな大腿骨を掴めるようにしてください。ピンセットで骨を保持したまま、骨に沿って下方へ移動し、関節のすぐ下で最初の切断を行います。次に、大腿骨の長さに沿ってハサミを動かし、できるだけ体に近づけて切断します。この際、特に大腿動脈を切断すると、少量の出血が起こる可能性があります。大腿骨を取り出す際は、骨を損なわずにそのままの状態に保つことが非常に重要です。ここでご確認いただけるように、骨の両端は切断されたり損傷したりしていません。大腿骨を取り出した後、余分な組織をクリップで切り取り、大腿骨をPMI培地を入れた小さなディッシュに入れます。余分な組織を取り除く際は、大腿骨が乾燥しないように注意してください。この時点で、大腿骨を70% ethanolを含むディッシュに移し、氷上に5〜10分間置きます。このビデオでは、引き続き実験台で操作を行いますが、実験のこの段階からは、すべての操作を組織培養フード内で行ってください。骨をエタノールに浸した後、骨髄を除去するために、骨を滅菌培地を入れた大きめのディッシュに移します。これで、骨髄の除去と再懸濁を行う準備が整いました。インスリン用シリンジに滅菌培地を満たし、後で使用するために傍らに置いておきます。滅菌済みのピンセットで骨をつかみます。破片を捨てるための小さなプレートの上に骨を保持し、骨の両端の骨端を切除します。インスリン用注射器を骨の一端に挿入し、骨髄を15 mLの培地へと洗い出します。骨髄がすべて洗い流されるまで、さらに1〜2回骨を洗浄します。骨髄が洗い流されると、骨はほぼ完全に白くなります。洗浄した骨を廃棄用ディッシュに入れ、もう一方の大腿骨でも同様の手順を繰り返します。完了後、洗浄工程で分散しなかった骨髄の塊を穏やかに分散させ、単一細胞懸濁液を作成します。これにはピペッティングで5〜10分かかります。単一細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに移し、10 mLの培地でプレートを少なくとも3回洗浄します。毎回、細胞を遠心分離して沈殿させ、培地を除去した後、チューブの底を指で強く手早くかき混ぜて細胞を再懸濁させます。赤血球（RBC）を除去するために、水ライシスを行います。赤血球除去の別の方法として、塩化アンモニウムライシスがあります。どちらの手法も、以前のJoVEビデオ記事で詳述されています。マウスリンパ節からのCD4陽性T細胞の単離についてはJoVE第9号（MACS精製法）、ラットサイトカインからのT細胞増殖因子の調製についてはJoVE第10号をご参照ください。RBC（赤血球）を除去した後、細胞の培養準備が整いました。樹状細胞の培養手順を説明する前に、インキュサイトについてご紹介します。インキュサイトを使用すると、インキュベーター内での樹状細胞の増殖を追跡できるため、細胞がどのように挙動するか、あるいは不適切な挙動を示すかを確認することができます。培養セットアップ後、適切なサイズのトレイに配置し、IncuCyteのサイトを閉じます。次に、コンピューターで時間間隔を設定し、撮影したいウェルを選択すれば、IncuCyteが自動的にデータを収集します。本プロトコルの動画では、in vitroにおける樹状細胞の形態変化を示します。これらのビデオはIncusサイトプログラムから直接書き出されたものです。樹状細胞が1日目から11日目にかけて分化するにつれ、細胞が肥大し樹状細胞の表現型へと変化する真の形態変化を確認することができます。溶血させて赤血球を除去した後、細胞を一次樹状細胞培地で洗浄し、1mlあたり5 million個で播種します。これらの細胞は、まず一次樹状細胞培養培地で培養し、その後、40 ng/mLのIL-4および100 ng/mLのTNF-αを添加した二次DC培地で培養します。これらのサイトカインは、単球由来樹状細胞に類似した成熟樹状細胞への分化を促進します。それでは、培養過程における細胞の状態と、経時的な維持方法について説明します。細胞を播種した後、最初の培地交換まで樹状細胞を72時間培養することができます。ここでは、1日目に細胞を播種した直後の典型的な培養状態を示します。そして、こちらが細胞の様子です。3日目には、細胞がプレートに接着し始めていることが確認できますが、典型的な樹状細胞の表現型はまだ呈していません。4日目には、培地を除去し、新鮮な一次DC用培地を10 mL添加して培地を吸引します。4日目に、リンパ球およびその他の非接着細胞を除去します。ここで、最初の播種から7日後となるよう、さらに3日間インキュベーターに戻します。典型的な培養状態は以下のようになります。これで、細胞を継代し、再播種するタイミングであることがわかります。7日目に、培地を吸引し、300 mMの滅菌EDTAを添加して5分間インキュベートすることで、プレートから樹状細胞を回収します。次に、プレートを45度の角度に保持し、プレートの背面に向けてEDTA溶液をピペッティングして、繰り返し洗浄します。付着しているすべての樹状細胞を完全に取り除くため、この操作を数分間行います。細胞を50 mLコニカルチューブに回収し、二次DC培地で2回洗浄します。その後、細胞を再懸濁し、1プレートあたり500万個の密度で播種します。播種直後の7日目の樹状細胞は、速やかにプレート底面に沈降して接着し、展延し始めます。Zichyサイトのビデオでご覧いただけるように、このビデオは、7日目に行われた初期の再播種から9日目の初期にかけての樹状細胞の分化を示すため、インキュベーター内で2日間にわたって撮影されました。形態学的に、樹状細胞は抗原パルスによって活性化させることができ、ここでは2 µg/mLのLPSと、ova特異的なCD4陽性T細胞を持つOT-IIマウスから精製したT細胞に使用するための100 µg/mLのovaを添加します。別の抗原を使用する場合は、樹状細胞をパルスさせるために最適な抗原濃度を使用することが重要です。ここで、LPSの最終濃度が20 mL中で2 µg/mLとなり、ovaが20 mL中で100 µg/mLとなるように、ovaとLPSをプライマリ培地に添加します。これは、培養10日目の樹状細胞の典型的な写真です。この写真から、形態が抗原提示細胞に非常に典型的であることがわかります。常にFACsを用いて、CD 11 C陽性樹状細胞の割合を確認してください。これは、実験に使用する樹状細胞の培養液が比較的純粋であることを確認するための操作です。ここでは、SEN instruments社のIncyteを用いて、10日目にLPS処理および抗原パルスを行った樹状細胞の活性化をモニタリングします。このビデオは、LPS、val、およびペプチドを添加した直後の24時間を記録したものであり、樹状細胞がより活性化し、明らかな形態学的変化が生じることが示されています。抗原パルスによって樹状細胞が活性化された後、300 millimolar EDTAでインキュベートし、プレートを洗浄することで、再び細胞を回収できます。次に、細胞を遠心分離して回収し、50 mlsのRPMI培地で2回洗浄して過剰な抗原を除去し、適切なセルトラッカー染料でラベル付けします。本実験では、鼠径リンパ節内の細胞をイメージングします。ここに示されているマウスの側腹部の真皮内に、200万から500万個の樹状細胞を注入します。その後、樹状細胞がトレーニングリンパ節にホーミングするまで24時間待ちます。このビデオでは、樹状細胞は青色のセルトラッカー染料であるCMF two hcでラベル付けされています。volinに抗原特異性を持つ、ラベル化されたT細胞と相互作用する樹状細胞を確認できます。これらのT細胞はccf SEでラベル化されています。分子プローブとして、C-M-T-M-Rまたはその他のセルトラッカー染料を使用することも可能です。これは、樹状細胞と相互作用するT細胞の初期活性化段階です。これらは抗原特異的であるため、T細胞が青色で標識されたDCの突起に付着していることがわかります。以上で、2ボタンイメージング実験におけるマウス由来骨髄樹状細胞の調製および使用法を示すプロトコルを終了します。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

この記事では骨髄での蛍光融合蛋白質の表現のための詳しいプロトコル由来樹状細胞とマクロファージを提供します。手法は骨髄の伝達レトロ ウイルス構造続いてマクロファージへの分化と樹状に前駆細胞の in...

マウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージの蛍光融合タンパク質の発現

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

学ぶマウス骨髄由来樹状細胞の培養法と2光子イメージングを用いた免疫応答の可視化。抗原提示細胞の成熟過程とT細胞との相互作用をリアルタイムで観察する手法を解説。

2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

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