2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

骨髄からの樹状細胞の調製は、免疫系の2つのボットンイメージングにおけるin vitroまたはin vivo実験に使用できる抗原提示細胞の優れた供給源を提供します。抗原提示細胞の導入により、生きたリンパ節の状況下での抗原特異的な細胞細胞相互作用の研究が可能になります。ここでは、骨髄の無菌分離と成熟樹状細胞の作製のための培養技術を実演します。

さらに、樹状細胞の発達を1日目から11日目まで追跡します。その様子を、匂い技術を用いたインキュベーターの動画や静止画で表現しています。最後に、ミラーリングリンパ節のOT2T細胞にコーブ抗原を提示する骨髄由来樹状細胞を示します。

こんにちは、近くのカリフォルニア大学のマイカ・ヘイレン研究室のメラニー・マシューです。細胞が成長している間、プローバー中に内部で何が起こっているのか疑問に思ったことはありませんか?今日。

私たちのプロトコルの一部として、私たちはサイトにSいくつかの機器を使用する方法を示すつもりです。インクのようなサイトでは、インキュベーター内の細胞培養の成長を追跡できます。このプロトコールでは、マウスから骨髄由来細胞とグループ細胞を分離し、調製する方法を示します。

だから、私が最初に行う方法を示すつもりは、大腿骨を取り外し、骨髄を分離することです。次に、動物を70%エタノールで濡らします。動物の正中線に沿って最初の切開を行います。

次に、ここで示しているように脚の内側を切ります。大腿骨の上の筋肉組織を露出させるには、筋肉を脇に引っ張って、解剖ピンセットで大きな大腿骨をつかむことができる必要があります。解剖ピンセットで骨を押さえながら、骨を下に移動し、関節のすぐ下に最初の切り込み

次に、はさみを大腿骨の長さまで動かし、できるだけ体の近くに切るようにします。これにより、特に大腿動脈を切った場合、少し血が混じる可能性があります。大腿骨を切除するときは、骨が無傷であることが非常に重要です。

ご覧の通り、骨の端は切断されたり、破壊されたりしていません。大腿骨を取り外したら、追加の組織を切り取り、大腿骨をPMIメディアの小さな皿に入れます。追加の組織を切除するときは、大腿骨が乾燥しないように注意してください。

この時点で、大腿骨を70%エタノールを含む皿に移し、氷の上に5〜10分間置く必要があります。このビデオでは、引き続きラボベンチで説明します。ただし、実験のこの段階では、すべてを組織培養フードに移す必要があります。

骨をエタノールに浸したら、骨髄を取り外すために、骨を滅菌培地の大きな皿に移すことができます。これで、骨髄を切除して再懸濁する準備が整いました。インスリン注射器に滅菌培地を充填し、後で使用するために横に置きます。

滅菌ピンセットで骨をつかみます。捨てられたピースのために小さなプレートにかざし、骨端または骨の端を両側から切り取ります。インスリン注射器を骨の片側に置き、骨髄を骨から15ミルの培地に洗い流します。

骨髄全体が洗い流されるまで、さらに1〜2回骨を洗い流します。骨髄が骨から洗い流されると、骨髄はほぼ完全に白くなります。きれいな骨を捨て皿に入れ、もう一方の大腿骨のプロセスを繰り返します。

これが完了したら、洗浄プロセスでバラバラにならなかった骨髄片を穏やかに破壊して、単一細胞懸濁液を作成します。これにはピペッティングに5〜10分かかります。50ミルのコニカルチューブにシングルセル懸濁液を入れ、10ミルの培地でプレートを少なくとも3回洗浄します。

毎回、細胞をスピンダウンし、培地を取り出し、チューブの底に指をしっかりと勢いよく擦り付けて細胞を再懸濁します。赤血球や赤血球を除去するために、水溶解を行います。赤血球除去の別の方法は、塩化アンモニウム溶解です。

どちらの方法も、以前のJoVEビデオ記事で説明されています。Milan max purification JoVE issue nine を使用したマウスリンパ節からの CD 4 陽性 T 細胞の単離とラット細胞 JoVE からの T 細胞成長因子の調製。問題10.

RBCを取り除いた後、あなたは今、自分自身を培養する準備ができています。そこで、デンドリ細胞培養についてご紹介する前に、incusのサイトについてご紹介したいと思います。インカスサイトでは、インキュベーター内での細胞培養の成長を予測できるため、インキュベーターがどのように振る舞うか、または誤動作するかを自分自身で監視できます。

培養物をセットアップしたら、適切なサイズのトレイに置き、インカスサイトをスライドさせて閉じます。次に、コンピューターで時間間隔を設定し、画像化したいウェルを選択して、インクサイトにデータを収集させます。この動画では、このプロトコルで、樹状細胞の形態変化をin vitroで示しています。

これらのビデオは、Incusサイトプログラムから直接エクスポートされました。樹状細胞は1日目から11日目まで発達するため、樹状細胞が拡大して樹状細胞の表現型をとるにつれて、真の形態変化が見られます。RBCを溶解し、それらを除去した後、細胞を一次樹状細胞培地で洗浄し、500万/milでプレーティングします。

これらの細胞は、最初に一次樹状細胞培養培地で培養し、その後、40ナノグラム/mil IL 4および100ナノグラム/mil TNFアルファを添加した二次DC培地で培養する必要があります。これらのサイトカインは、単球由来の樹状細胞に似た成熟樹状細胞の発達を助けます。そこで、今度は文化が発展するにつれてどのように見えるか、そしてそれらを時間の経過とともにどのように維持するかをお見せします。

細胞を播種したら、最初の培地交換の前に樹状細胞を72時間培養できます。ここでは、1日目に細胞をプレート化した直後の典型的な培養液を示します。そして、これがセルの様子です。

3日目には、細胞がプレートに付着し始めていますが、古典的な樹状細胞の表現型は採用していないことがわかります。4日目に、メディアを取り出し、メディアの10ミルの新鮮な一次DCメディア吸引を追加します。4日目には、他の非接着細胞のリンパ球を切除します。

これで、最初のめっきから7日間、さらに3日間、インキュベーターに戻ることができます。ここでは、あなたの典型的な文化がどのようなものになるかをご紹介します。セルを分割して再置換する時が来たことがわかります。

7日目に、培地を吸引し、次に300ミリモルの滅菌EDTAを添加してこれを5分間インキュベートすることにより、樹状細胞をプレートから除去します。次に、プレートを45度の角度で保持し、EDTA溶液をプレートの背面にピペッティングして、プレートを繰り返しすすぎます。これは、付着した樹状細胞をすべて除去するために数分間行われます。

細胞を50ミリの円錐形チューブに集め、二次DC培地で2回洗浄します。その後、細胞を再懸濁し、プレートあたり500万個の細胞で播種します。新たに再播種された7日目の樹状細胞は、プレートの底に急速に沈殿し、付着して広がり始めます。

このZichyサイトのビデオでご覧いただけるように、このビデオはインキュベーターで2日間にわたって撮影され、7日目に行われた最初の再プレーティングから9日目の初めまでの樹状細胞の発達を示しています。形態学樹状細胞は、卵子特異的CDを有するOTマウス2匹マウスから精製されたT細胞で使用するための卵子用の卵子とLLPSあたり2マイクログラムをここに100マイクログラム追加することにより、抗原パルスで活性化することができる。あなたが別の抗原を使用している場合、それはあなたがここであなたのdcsをパルスするために抗原の最適な濃度を使用していることを確認することが重要です、OVとLPSは、LPSの最終濃度が20ミルでミルあたり2マイクログラムになるように一次培地に追加されます、OVは20ミルでミルあたり100マイクログラムになります。

これは、樹状細胞の典型的な10日目の培養がどのように見えるかの写真です。この写真では、その形態が抗原提示細胞の非常に典型的なものであることがわかります。CD 11 C陽性樹状細胞の割合は、常にファックスで確認する必要があります。

これは、実験で使用する樹状細胞の比較的純粋な培養物を確保するためです。ここでは、SEN機器のインク状部位を使用して、10日目に抗原パルスでLPS処理した樹状細胞の活性化をモニターします。このビデオは、LPSとvalおよびペプチドを添加した直後の24時間にわたるもので、樹状細胞はより活性化し、いくつかの明らかな形態学的変化があります。

樹状細胞が抗原パルスで活性化されたら、300ミリモルEDTAでインキュベーションし、プレートを洗浄することで、樹状細胞を再び収集できます。次に、細胞をスピンダウンし、50ミルのRPMI培地で2回洗浄して追加の抗原を除去し、適切なセルトラッカー色素で標識します。この実験では、鼠径リンパ節の細胞をイメージングします。

ここに示されているマウスの脇腹領域に、200万から500万の樹状細胞を経皮に注入する必要があります。その後、樹状細胞がトレーニングリンパ節に帰宅するまで24時間待ちます。このビデオでは、樹状細胞をCMF two hc、青色細胞トラッカー色素で標識しています。

樹状細胞が、ボリンに抗原特異的な標識T細胞と相互作用しているのを見ることができます。これらのT細胞はccf SEで標識されています。また、分子プローブには、C-M-T-M-Rまたは他のセルトラッカー色素のいずれかを使用することもできます。これは、DCと相互作用するT細胞の初期の活性化段階です。

抗原特異的であるため、T細胞が青色のラベルのdcの触手にくっついていることがわかります。これで、マウス由来の骨髄樹状細胞の調製と使用を2ボットンイメージング実験で実証するプロトコルは終了です。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなた自身の実験に頑張ってください。