Name: 養子DTHの誘導後の耳のイメージングエフェクターメモリーT細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学ぶラット耳における遅発型過敏反応（DTH）誘導とエフェクター・メモリーT細胞の2光子顕微鏡イメージング手法。GFP標識T細胞を用いた生体内免疫応答の可視化方法です。

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養子DTHの誘導 Joveの資料を参照してください ： <a href="/index/Details.stp?ID=325">ラットにおける養子遅延型過敏症の誘導とモニタリング</a> クリスティンビートン、ジョージK. Chandy 生理学と生物物理学専攻、カリフォルニア大学アーバイン校 J.可視化実験、第8号ここで、我々は、貪食抗原提示細胞の可視化を可能にするために非標識抗原と1:1の比率で抗原（卵白アルブミン）テキサスレッドコンジュゲートさを使用して、このプロトコルを変更しました。 耳組織の収穫<ol><li>あなたの承認された動物のプロトコルに記載されている手順で、目的の時間の時点でラットを安楽死させる。ここでは、イソフルラン麻酔薬の過剰摂取を、使用してください。これは、よく換気フード内にある密閉容器内で行われます。動物は、胸腔を開いて心臓を切断することによってのいずれかの斬首によって死んでいることを確認します。 </li><li>大きなハサミを使用すると、可能な限り動物の体に近づけるシングルカット、（図1）で耳を取り外します。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_0/Figure_1.jpg" alt="Figure_1.jpg"> 図1。ラットの耳の除去 </li><li>氷冷した1 × PBSまたはRPMI - 1640の約10 mlを入れた15 mlコニカルチューブに耳を置きます。あなたがイメージングのために組織を準備する準備が整うまで、氷上に組織サンプルを保管してください。 </li><li>できるだけ早く画像組織、我々は、収穫し、すぐに画像化組織と比較した場合、氷上で1〜2時間は、組織の細胞の運動性には目に見える効果がないこと、しかし、見つける。 </li></ol>イメージングのための組織の準備表皮と真皮層のI.除去 *注意 ：深い真皮層はそのまま保持されている必要があります。正しく行えば、大きな血管が損なわれることと耳の軟骨は公開されません。は炎症（コントロール条件）がない場合は特にこれは、難しいテクニックであり、それは解剖顕微鏡を使用すると便利です。 <ol><li> 10cmの組織培養皿の円錐管から組織とメディアの両方を置きます。 </li><li>手袋をはめた手では（図2）を上に向けて耳の背側と耳（遠位）の先端に軽くラットの耳をホールドして。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_1/Figure_2.jpg" alt="Figure_2.jpg"> 図2。耳オフトリム毛皮 </li><li>深い真皮から真皮を分離するために、閉じたデュモン＃5はさみの先端を使用しながら、耳の上、安定した組織で、親指で。また、耳の端が皮膚/深い真皮のオーバーハングを持つ場合、これはピンセットで把握することができ、ゆっくりと組織の下にある（図3）からこれを分離するために引っ張った。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_2/Figure_3.jpg" alt="Figure_3.jpg"> 図3。真皮上層の除去 </li><li>一度、皮膚の小さな領域が交互に優しく除去し、外れた皮膚を剥がしに真皮層と鉗子の間でカットするはさみを使って分離の手順を繰り返します、下にある組織から分離されています。 </li><li> 5 × 5 mmまたは抗原の注射の最初の部位（図4）から少なくとも3 mmである耳組織の大きな面積を公開しています。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_3/Figure_4.jpg" alt="Figure_4.jpg"> 図4。イメージングに曝露された組織 </li></ol> II。イメージングのステージに組織を保護<ol><li>準備組織よりも少し大きいサイズのプラスチック製カバースリップをカット。 </li><li> 3M Vetbondスライド全体™組織セーフ接着剤の薄層を広げる。 </li><li>レンズの紙やキムの組織の下側、準備組織の隅をつかみ（あなたがイメージする可能性がない場合）、メディアから削除し、DABは、余分なメディアを削除するに拭いてください。 </li><li>接着剤カバーしたスライド（すぐにウェットティッシュでVetbond治療法）に組織の端をタッチ。ゆっくりと（図5）スライドに触れないように最後は反対側で、フラットな組織を伸ばす <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_4/Figure_5.jpg" alt="Figure_5.jpg"> 図5。スリップをカバーするために組織をマウントします。 </li><li>反転組織サンプルでVetbond™を治す/スライドと組織とスライドは、45度の角度でダウンとほぼ直面しているように、メディアの貯水池に浸漬。角度を上下逆さまに組織を保持すると、曝露された組織の表面に硬化から余分な接着剤を防ぐことができます。組織の表面上に接着剤は、レーザー（図6）をブロックします。 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_5/Figure_6.jpg" alt="Figure_6.jpg"> 図6。 vetbond組織GLUを治すメディアに浸漬することによって、電子 注 ：ステップ2-5は、マスターに少し練習がかかる場合があります。初めて試みる前に破棄または余分な組織片で練習してみてください。 </li><li> DABスライドの底にシリコングリスを少量。 </li><li>灌流チャンバ内のスライドを置きます。灌流のメディアは、37 ° Cを流れると組織を追加する前に酸素をされていることを確認します。ゆっくりと灌流チャンバーの底部とプラスチック製のカバーガラスの間にシリコングリスでシールを作るスライドの端を押し下げます。 </li></ol> III。二光子イメージング<ol><li>明視野透過光を使用して、組織の上に焦点を当てる。ライトのすべての電源を切ります。 </li><li> 、レーザーのようにして多光子顕微鏡のシステムで必要とされる光電子増倍管を入れます。 </li><li>高秩序の繊維状タンパク質で第二高調波発生（SHG）（コラーゲンおよびミオシン）は、励起レーザーの半波長の信号を生成する。我々は、顕微鏡の"青"のチャンネルを使って視覚化できる450 nmでSHGにつながる、900nmの励起を使用してください。世代のSHGと非線形（二光子）のプロセスであるので、蛍光の二光子励起の場合と同様の光学"切片"の効果を提供します。並列で実行される線維が可視化されることはありませんが、SHGのピーク効率は、線維がレーザーに対して垂直になるときに発生します1。 </li><li>細胞をたっぷり使って良好な結像領域を見つけ、細胞の大部分が中央にあり、イメージングを開始するようにして取得面積を設定します。注：DTH反応では、T細胞および他の細胞浸潤はしばしば他の領域は、セル2の浸潤性を欠いている間に一緒に集中して発見された。そのため、画像への最適な領域を見つけるために組織を検索し、時間がかかることがあります。 </li><li>撮像中にセルの速度と極性を評価することにより細胞の生存を確認してください。最小限の写真 - ダメージを確保するために許容可能な画質を提供する最小のレーザパワーを使用してください。 </li><li>必要に応じて新しい組織の準備のために交換する。 </li></ol>

<ol><li>Koo, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+voltage-gated+potassium+channel+Kv1.3+inhibits+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo.</a> J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).</li>
<li>Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+activation+and+T+lymphocyte+infiltration+in+allergen-induced+late+phase+skin+reactions+and+classical+delayed-type+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity.</a> J Immunol. 147, 816-822 (1991).</li>
<li>Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoaggressive+effector+T+cells+in+the+course+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+visualized+in+the+light+of+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.</a> J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).</li>
<li>Kawakami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+effector+cell+trafficking+and+autoantigen+recognition+within+the+unfolding+autoimmune+encephalomyelitis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion.</a> J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Imaging+of+Effector%2FMemory+T+Cells+During+DTH+and+Suppression+by+Kv1.3+Channel+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block.</a> Immunity. , In Press (2008).</li>
</ol>

養子dthの誘導後の耳のイメージングエフェクターメモリーt細胞

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

エフェクター/メモリーTリンパ球-遅延型過敏症（DTH）は、メインプレイヤーがCCR7される免疫反応です。ここで、我々は、ラットの耳にDTH反応の進行を誘導し、記録するための方法を示しています。エフェクター/メモリーT細胞応答-これは、CCR7の二光子励起イメージング用ラットの耳組織の準備のデモが続いている。 エフェクター/メモリーT細胞株（ビートン、C J.可視化実験、第8号） -養子DTHは、GFPで標識したOVA特異的CCR7の腹腔内注射により誘導される。次に、細胞を可視化を可能にするためにテキサスレッドの卵子と卵子共役の1:1混合（OVA - TR）と生理食塩水（対照耳）ともう片方の耳を注入することにより、チャレンジの48時間前のためにラットで平衡化されている常駐抗原提示細胞の。 我々は第二高調波発生によるコラーゲン線維の可視化と組み合わせて、イメージングのための有用な組織調製の方法免疫応答の間に深い真皮層内の細胞の運動性を説明。耳の組織は、5 × 5mmの正方形（少し大きめが良い）に切断し、その後37℃でのイメージングチャンバー内にシリコーングリースを使用して保護し、酸素バブリング組織培養培地で灌流されているVetbond™を使用してプラスチック製のカバースリップ、上にマウントされています° C 。

ここでは、ラットの耳で遅延型-過敏（DTH）反応の進行を誘導し、記録するための方法を示しています。これは、エフェクター/メモリーT細胞応答の二光子イメージング用ラットの耳組織の準備のデモが続いている。

養子DTHの誘導後の耳のイメージングエフェクターメモリーT細胞

遅延型過敏症（DTH）は、CCR7陽性のエフェクター/メモリーTリンパ球が主役となる免疫反応である。本研究では、我々は…を実証する。

こんにちは、メラニー・マシューです。私はカリフォルニア大学アーバイン校、生理学・生物物理学部のMicah Hollins研究室の大学院生です。本日は、Christine Beaton博士と共に、ラットの耳におけるエフェクター記憶T細胞集団をどのようにイメージングするかについて解説します。まず、Christine Beaton博士がラットの耳に遅延型過敏症（DTH）を誘導します。その後、2光子顕微鏡を用いたラット耳のin situイメージングへと移ります。2日前に、LewisラットにGFPラベル化したアルブミン特異的T細胞を注射しました。本日は、同じラットの耳を用いて試験を行います。右耳に albumin を注射し、左耳には PBS のみを注射します。注入するアルブミンの用量は 20 µg / 20 µL です。使用しているアルブミンは、Texas Red標識アルブミンと未標識アルブミンを 1:1 で混合したものです。ここからは、注入の手順を実際に示します。私は右利きですので、左手を使います。指を1本は耳の下に、もう1本を耳の上に置いて皮膚を伸ばし、針の位置を正確に確認して、非常に薄い2層の皮膚の間にある空気層に挿入できるよう、左手のグローブを外しました。そのため、極めて細い27ゲージの針を使用しています。したがって、向きを変えると、Texas red がどこに注入され、PBS がどこに注入されたかが明確にわかります。ここでは、負荷から42時間が経過した状態で、バネ仕掛けのマイクロメーターを使用して耳の厚さを測定します。アルブミンを負荷した右耳と、負荷していない左耳の両方を測定し、その厚さの差によって炎症の強度を判断します。おー、62 0 60 0 61、0 60、または58、または57、または57です。もう一方の耳は4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50です。こんにちは。クリスティン・ビートンさんが、DTH反応の測定後に取り除いたラットをちょうど届けてくれました。氷上でこちらに運んできました。これはラットの左耳です。現在はIan Parkerの研究室におり、二光子顕微鏡観察を行っています。それでは、これらの耳をin situ 2光子イメージング用に準備します。まず、こちらのラットの耳の基部を準備します。この部位は組織がかなり厚く、毛が生えているため、そのまま切除し始めると乱雑になってしまいます。まず最初に行うのは、被毛を一部カットすることです。耳を優しく保持します。親指と人差し指の間で保持することで、指を使って組織をより簡単に制御できるようになります。ピンセットよりもこちらを好んで使用します。ピンセットでは、組織の状態を十分に感じ取ることが難しく、常に組織を損傷させる懸念があるからです。そのため、操作中の感触を正確に把握したいと考え、指で直接扱う方法を好んでいます。これはラットの耳において、ここから真皮層が剥がれている様子です。被毛を刈り取っていた際、真皮の一部をそっと切り取り、そのまま剥離させることができました。これを行うには、非常に小さな解剖用はさみ、具体的には適した曲弯はさみを使用します。組織を突き刺さないように注意し、耳の付け根から上に向かって、真皮層を慎重に切り除いていきます。イメージングに非常に大きなウィンドウを設ける必要はありません。組織に浸潤する細胞の良好な画像を撮影するには、ちょうどこのあたりの領域があれば十分です。ご覧のように、耳の付け根から先端にかけて、ほぼ全域にわたって血管が保持されています。この領域全体が、DTH（遅延型過敏反応）のイメージングに非常に適しています。そこで、露出させたこの組織片を切出し、イメージングステージに接着させることができる小さな組織片を作成します。ここで切断し、向きを変えます。ここを切断できます。これで、2光子顕微鏡でのイメージング用に準備できる適切なサイズの組織片が得られました。これらは、組織のサイズに合わせてカットした破損しにくいプラスチック製のカバーガラスです。次に、Betbondを用いて組織をこれらにマウントします。そして、これらの破損しにくいプラスチック製カバーガラスを、シリコングリスを使用してin situイメージングステージに固定します。この小さな耳組織の断片を使用します。少し湾曲しているため、接着して固定する際に平らに広げる必要があります。理想的ではありませんが、これで十分です。次に、カバーガラスを1枚用意してカットします。耳のサイズをおおよそに見積もり、想定よりも少し大きめにカットしてください。組織をカバーガラスに固定するため、Betlongという組織に安全な強力接着剤を使用します。これは3M社から入手したもので、カバーガラス上に数滴滴下して使用します。多すぎないようにします。また、均等に広がるようにすることも重要です。ですので、レンズペーパーを小さく切り、その角を使ってカバーガラス全体に接着剤を吸い込ませるように広げます。接着剤を少し多めに塗布します。この接着剤は水に触れるとすぐに硬化するため、組織サンプルの取り扱いには十分注意してください。ここでは、湾曲した部分にあるため、おそらくイメージングに使用しない組織の端を掴みます。軽く水分を拭き取ります。レンズペーパーを用いて、底面を完全に乾燥させます。そして、このラット耳組織の角をカバーガラスに接触させます。そして、触れた部分はすぐに硬化するはずです。残りの部分は、端をそっと押さえて、少しだけ平らにします。これで、良好なイメージングフレームが得られるはずです。次に、組織を培地に浸して接着剤を硬化させます。接着剤が組織の上側に付着するのを防ぐため、組織を裏返しにし、まず角からゆっくりと培地のリザーバーに浸します。これにより組織がしっかりと固定され、組織イメージングチャンバー内で撮影することが可能になります。それでは、in situイメージング用に準備した脳組織の切片をステージにマウントします。こちらが底面にシリコングリスを塗布した組織片です。これを培地の流れの中に静かに配置します。これで、シリコングレースによって組織がステージの底面に固定されました。温度プローブをすぐ隣に配置し、培地の流れを確認します。それでは、ピント合わせを行います。フォーカス用の新しい光源、ブライトフィール照明を点灯します。20倍の対物レンズを使用し、チャンバー内へと下げていきます。組織に触れないように注意してください。接眼レンズを覗き、耳組織に焦点を合わせます。そこにあります。ここでは、ラットの耳の真皮層にある自発蛍光を持つ緑色の毛包が示されています。この毛包の周囲は、密なコラーゲン層で覆われています。Tエフェクターメモリー細胞のTフォトンのイメージングを行う際、我々はこの層を除去します。自家蛍光を持つ毛包と、真皮上層の明るいコラーゲンが画像を妨げます。さて、ここではTexas red結合ボリンを取り込んだAPCが、これらの青いコラーゲン線維に沿って配置されているのがわかります。コラーゲン線維が青く見えるのは、コラーゲン線維に沿った2光子イメージングで得られる第二高調波発生によるものです。T細胞は非常に高い運動性を持ち、コラーゲン繊維に沿って上下に移動しながらAPCと相互作用します。このビデオでは、Christine Beaton博士がルイスラットにおいて養子移行性DTHを誘導させる様子をご覧いただきました。以上の通り、イメージングのための耳の前処理、反応性Tエフェクターメモリー細胞、ラットの耳、およびそれらを実施するための2光子技術について説明しました。

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生物学

ラットにおけるアクティブ遅延型過敏（DTH）の誘導とモニタリング

ラットにおける養子遅延型過敏症の誘導とモニタリング

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炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

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眼球組織におけるエフェクター記憶T細胞の増加を伴う慢性自己免疫ドライアイラットモデル

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