養子DTHの誘導後の耳のイメージングエフェクターメモリーT細胞
August 14th, 2008
ここでは、ラットの耳で遅延型-過敏（DTH）反応の進行を誘導し、記録するための方法を示しています。これは、エフェクター/メモリーT細胞応答の二光子イメージング用ラットの耳組織の準備のデモが続いている。
こんにちは、私はメラニー・マシューです。私はカリフォルニア大学アーバイン校の生理学・生物物理学部のMicah Hollins研究室の大学院生です。そして今日は、クリスティン・ビートン博士とともに、ラットの耳の応答効果または記憶T細胞集団をどのようにイメージするかをお見せします。
クリスティン・ビートン博士は、最初にラットの耳に遅延型過敏症DTHを誘発します。次に、2つの顕微鏡写真によるラットの耳のin situイメージングに移ります。2日前、私はアルブミン特異的T細胞の標識GFPをhyperでルイスに注射しました。
そして今日は、同じネズミを耳に当てて挑戦します。そこで、右耳にアルブミンを注射します。そして、左耳にはPBSを注入します。
私が注射しているアルブミンの用量は、20マイクロリットルで20マイクログラムです。そして、私が使用しているアルブミンは、アルブミンとラベルなしのテキサスレッドの1対1の混合物です。だから、これは私がどのように注入するかをあなたに示そうとしている右です。
ですから、私は左手を持っていますが、右利きです。そこで、左手は手袋を外して、片方の指を耳の下に、もう片方の指を上にして皮膚を伸ばすことができるようにしました。これにより、針で自分がどこにいるのかを正確に確認し、空気中の2つの皮膚の層の間に入ることができました。そのため、27ゲージの針を使って、非常に細いものを入れています。
ですから、裏返すと、テキサスレッドがどこに行ったのか、PBSがどこに行ったのかが確実にわかります。さて、ここでのチャレンジから42時間後、バネ仕掛けのマイクロメーターを使って耳の厚さを測定します。そこで、アルブミンでダメージを受けた右耳とそうでない左耳の両耳を測定し、厚さの違いから炎症の強さ
を知ることができます。ああ、62 0 60 0 61、0 60、58、57、57。そして、もう一方の耳は4、49、4、55、4、48.4、47、4、4、50です。Hi.So クリスティン・ビートンは、DTH反応を測定した後に駆除したラットを私たちに提供しました。
私たちは彼らを氷の上でここに運びました。これがネズミの左耳です。そして今、私たちはイアン・パーカーの研究室で2光子顕微鏡検査を行っています。
そこで、これらの耳をin situ 2光子イメージング用に準備します。そこで、ネズミの耳の1つを耳の付け根に準備します。ティッシュはずっと厚くなっていて、髪の毛が突き出ているので、切り込み始めると少し乱れてしまいます。
だから、まず最初にやることは、その髪の毛を少し切ることです。耳を優しく押さえているだけです。私の指は、親指と人差し指で組織を挟むと、実際に組織を制御するのがとても簡単になります。
鉗子を使うよりも鉗子を使うのが好きですが、それはただ、組織が何をしているのかを簡単に感じることができず、常に組織を傷つけることを心配しているからです。ですから、私たちはそれを使って何をしているのかを感じることができるようにしたいのです。だから、私はただ指を使うのが好きです。
これは、ネズミの耳でここから剥がれ落ちる真皮層です。だから、髪の毛の一部を切り落としているときに、真皮の一部をやさしく刈り取ることができました。そのために非常に小さな解剖ハサミがいくつかあるので、素敵な湾曲したハサミがあります。
ティッシュをジャブするのは避け、耳の付け根から上に向かって、真皮層を優しく切り取るだけです。そのため、イメージングにそれほど大きなウィンドウは必要ありません。ちょうどここにあるこの領域は、組織に浸潤する細胞のいくつかの素晴らしい画像を取得するのに十分です。
ですから、耳の付け根にはまだ無傷の血管がいくつかあり、耳の先端までほぼずっと続いていることがわかります。この領域全体は、DTHのイメージングに非常に適しています。そこで、露出した組織を切り取って、イメージングステージに接着できる小さな組織を作ります。
だから、ここで切り込みを入れて、ひっくり返してください。ここをカットできます。私たちは、イメージングのために2つのフォトンスコープで準備できる素敵な小さな組織片を持っています。
これらは、ティッシュのサイズにカットする壊れないプラスチック製のカバースリップです。そして、ベットボンドを使用して組織をこれらに取り付けます。そして、この壊れにくいプラスチックカバースリップをシリコーングリースで現場のイメージングステージに固定します。
この小さな空気ティッシュを取りますが、少し湾曲しているので、接着するときに平らにする必要があります。理想的ではありませんが、うまくいくでしょう。だから、このカバースリップを1枚取ってカットし、耳のサイズを見積もり、思ったよりも少し大きくカットするのです。
ティッシュをカバースリップに取り付けます。bet longと呼ばれるティッシュに安全な瞬間接着剤を使用しています。3Mからもらって、それを数滴垂らしてカバースリップに貼るだけです。
あまり多くは持ちたくないです。また、それが均等に広がっていることも確認する必要があります。そこで、レンズペーパーを少し取り、その角を使ってカバースリップに接着剤を吸い上げます。
余分な接着剤で少し上に行くと、この接着剤が水に触れるとすぐに硬化します。ですから、組織サンプルには細心の注意を払う必要があります。そこで、ここではティッシュの角をつかみますが、湾曲した部分にあるため、おそらくイメージしないでしょう。
少しだけ乾かします。その底はレンズペーパーの上だけなので、すべて乾いています。そして、その角を触っていきます、このネズミ耳ティッシュをカバースリップに
。そして、触れたところはすぐに治るはずです。残りの部分は、端をそっと押すだけで少し平らにします。ですから、うまくいけば、素敵なイメージングフレームを手に入れることができます。
だから今、私がやろうとしていることは、接着剤を培地に浸して硬化させることです。そこで、接着剤が組織の上に付着するのを防ぐために、接着剤を逆さまにして、まずメディアのリザーバーにゆっくりと一角浸し、きれいに貼り付けて、組織イメージングチャンバーで画像化できるようにします。では、in situイメージング用に準備したティッシュ、つまりビールティッシュをステージにマウントします。
これが、底にシリコングリースが付着したティッシュで、メディアの流れにそっと置くだけです。今、それはステージの底に貼り付けられているシリコーングリースです。メディアのすぐ隣にある温度プローブでメディアの流れを明るくします。
そして今、私たちは焦点を当てます。ですから、私は私たちの焦点、新しい光、私たちの明るい皮を向けるつもりです。そこで、20倍の対物レンズをチャンバー内に下げます。
ティッシュに触れないように注意してください。接眼レンズを覗き込み、耳の組織に焦点を合わせます。そして、それはそれです。
ここでは、ラットの耳の真皮層に自家蛍光性の緑色の毛包が見られます。この毛包を囲むのは、コラーゲンの密集した層です。これは、TフェクターメモリセルのTフォトンイメージングのために除去する層です。
自己蛍光性の毛包は、上真皮層の明るいコラーゲンのように画像を覆い隠します。さて、ここでは、テキサスレッドの共役ボリンを取り込んだAPCがあり、これらの青いコラーゲン繊維に沿って寄り添っていることがわかります。コラーゲン線維が青色なのは、コラーゲン線維に沿って光子イメージングに入る第2高調波発生によるものです。
運動性の高いtcellがあります。彼らはコラーゲン繊維を上下に這い上がり、APCと相互作用します。このビデオでは、クリスティン・ビートン博士がルイスラットに養子縁組DTHを誘導する様子を見ました。
そして、イメージングのための耳の準備、応答性Tエフェクター記憶細胞、ラットの耳、そのための2つの光子技術を紹介しました。
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概要
この記事では、ラットの耳における遅延型過敏反応（DTH）の誘導と記録の方法を示し、続いてT細胞反応の二重光子イメージングのためのラットの耳組織の準備について説明します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 免疫学
- 神経科学
- 生物物理学
背景
- 遅延型過敏反応（DTH）は重要な免疫反応です。
- T細胞のダイナミクスを理解することは、免疫学研究にとって重要です。
- 二重光子顕微鏡法により、細胞反応のin situイメージングが可能になります。
- ラットモデルは、免疫反応を研究するために一般的に使用されています。
研究の目的
- ラットの耳におけるDTH反応を誘導し記録すること。
- エフェクターおよびメモリーT細胞集団を視覚化すること。
- in vivoでのT細胞の挙動の理解を深めること。
使用された方法
- ラットの耳組織におけるDTHの誘導。
- GFP標識T細胞の注射。
- イメージングのための二重光子顕微鏡法。
- T細胞反応のin situ分析。
主な結果
- ラット耳モデルにおけるDTHの成功的な誘導。
- 二重光子顕微鏡法を用いたT細胞集団の視覚化。
- in vivoでの免疫反応のダイナミクスに関する洞察。
- 示された方法は、さらなる免疫学研究に適用できる。
結論
- この方法は、DTH反応を研究するための信頼性の高いアプローチを提供します。
- 二重光子イメージングは、T細胞の挙動を観察するのに効果的です。
- この研究は、免疫反応の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of effector memory T cell dynamics in a tissue-specific immune response, supporting mechanistic de-risking in immunology target validation. By combining adoptive DTH induction with two-photon imaging, it provides quantitative, spatially resolved data on T cell motility and antigen-presenting cell interactions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking cellular behavior to functional immune outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing CCR7- effector/memory T cell recruitment and activation in vivo.
- Operational Value: Enables functional validation of immunomodulatory targets through direct observation of T cell-APC interactions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating T cell motility patterns with inflammatory intensity in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized tissue explants for consistent, reproducible imaging of immune cell dynamics.
- Operational Value: Establishes a platform for quantitative readouts such as cell tracking, interaction frequency, and infiltration depth.
- Scalability: Uses minimally processed ear tissue compatible with high-resolution imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains immunological relevance by preserving native tissue architecture and cell-cell interactions during imaging.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal tracking of immune responses in the same model.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity in lead identification by providing direct evidence of target engagement in tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative refinement of immunomodulatory candidates based on real-time immune cell behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing T cell responses to antigen challenge in a controlled DTH model.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with standardized thickness and mounting for reproducible two-photon imaging.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cell velocity, track length, and spatial distribution relative to collagen and APCs.
- Translational Research: Ensures continuity from discovery to preclinical by using the same rat model for both induction and imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple immunology targets and antigen-specific T cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking through direct visualization of effector memory T cell function in tissue.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging conditions to improve reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking T cell dynamics to inflammatory outcomes in a predictive model.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by validating target effects on immune cell behavior prior to costly in vivo studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in adoptive T cell transfer, DTH induction, and two-photon microscopy.
- Dependent on access to two-photon microscopes with second harmonic generation capability for collagen visualization.
- Necessitates standardized tissue handling protocols to ensure consistent mounting and viability during imaging.
- Involves adaptation considerations when applying the ear preparation method to other tissue types or disease models.
- Limited by the need for antigen-specific T cell lines and appropriate controls to distinguish specific from nonspecific inflammation.
