養子DTHの誘導後の耳のイメージングエフェクターメモリーT細胞

こんにちは、メラニー・マシューです。私はカリフォルニア大学アーバイン校、生理学・生物物理学部のMicah Hollins研究室の大学院生です。本日は、Christine Beaton博士と共に、ラットの耳におけるエフェクター記憶T細胞集団をどのようにイメージングするかについて解説します。

まず、Christine Beaton博士がラットの耳に遅延型過敏症（DTH）を誘導します。その後、2光子顕微鏡を用いたラット耳のin situイメージングへと移ります。2日前に、LewisラットにGFPラベル化したアルブミン特異的T細胞を注射しました。

本日は、同じラットの耳を用いて試験を行います。右耳に albumin を注射し、左耳には PBS のみを注射します。

注入するアルブミンの用量は 20 µg / 20 µL です。使用しているアルブミンは、Texas Red標識アルブミンと未標識アルブミンを 1:1 で混合したものです。ここからは、注入の手順を実際に示します。

私は右利きですので、左手を使います。指を1本は耳の下に、もう1本を耳の上に置いて皮膚を伸ばし、針の位置を正確に確認して、非常に薄い2層の皮膚の間にある空気層に挿入できるよう、左手のグローブを外しました。そのため、極めて細い27ゲージの針を使用しています。

したがって、向きを変えると、Texas red がどこに注入され、PBS がどこに注入されたかが明確にわかります。ここでは、負荷から42時間が経過した状態で、バネ仕掛けのマイクロメーターを使用して耳の厚さを測定します。アルブミンを負荷した右耳と、負荷していない左耳の両方を測定し、その厚さの差によって炎症の強度を判断します。

おー、62 0 60 0 61、0 60、または58、または57、または57です。もう一方の耳は4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50です。こんにちは。クリスティン・ビートンさんが、DTH反応の測定後に取り除いたラットをちょうど届けてくれました。

氷上でこちらに運んできました。これはラットの左耳です。現在はIan Parkerの研究室におり、二光子顕微鏡観察を行っています。

それでは、これらの耳をin situ 2光子イメージング用に準備します。まず、こちらのラットの耳の基部を準備します。この部位は組織がかなり厚く、毛が生えているため、そのまま切除し始めると乱雑になってしまいます。

まず最初に行うのは、被毛を一部カットすることです。耳を優しく保持します。親指と人差し指の間で保持することで、指を使って組織をより簡単に制御できるようになります。

ピンセットよりもこちらを好んで使用します。ピンセットでは、組織の状態を十分に感じ取ることが難しく、常に組織を損傷させる懸念があるからです。そのため、操作中の感触を正確に把握したいと考え、指で直接扱う方法を好んでいます。

これはラットの耳において、ここから真皮層が剥がれている様子です。被毛を刈り取っていた際、真皮の一部をそっと切り取り、そのまま剥離させることができました。これを行うには、非常に小さな解剖用はさみ、具体的には適した曲弯はさみを使用します。

組織を突き刺さないように注意し、耳の付け根から上に向かって、真皮層を慎重に切り除いていきます。イメージングに非常に大きなウィンドウを設ける必要はありません。組織に浸潤する細胞の良好な画像を撮影するには、ちょうどこのあたりの領域があれば十分です。

ご覧のように、耳の付け根から先端にかけて、ほぼ全域にわたって血管が保持されています。この領域全体が、DTH（遅延型過敏反応）のイメージングに非常に適しています。そこで、露出させたこの組織片を切出し、イメージングステージに接着させることができる小さな組織片を作成します。

ここで切断し、向きを変えます。ここを切断できます。これで、2光子顕微鏡でのイメージング用に準備できる適切なサイズの組織片が得られました。

これらは、組織のサイズに合わせてカットした破損しにくいプラスチック製のカバーガラスです。次に、Betbondを用いて組織をこれらにマウントします。そして、これらの破損しにくいプラスチック製カバーガラスを、シリコングリスを使用してin situイメージングステージに固定します。

この小さな耳組織の断片を使用します。少し湾曲しているため、接着して固定する際に平らに広げる必要があります。理想的ではありませんが、これで十分です。次に、カバーガラスを1枚用意してカットします。耳のサイズをおおよそに見積もり、想定よりも少し大きめにカットしてください。

組織をカバーガラスに固定するため、Betlongという組織に安全な強力接着剤を使用します。これは3M社から入手したもので、カバーガラス上に数滴滴下して使用します。

多すぎないようにします。また、均等に広がるようにすることも重要です。ですので、レンズペーパーを小さく切り、その角を使ってカバーガラス全体に接着剤を吸い込ませるように広げます。

接着剤を少し多めに塗布します。この接着剤は水に触れるとすぐに硬化するため、組織サンプルの取り扱いには十分注意してください。ここでは、湾曲した部分にあるため、おそらくイメージングに使用しない組織の端を掴みます。

軽く水分を拭き取ります。レンズペーパーを用いて、底面を完全に乾燥させます。そして、このラット耳組織の角をカバーガラスに接触させます。

そして、触れた部分はすぐに硬化するはずです。残りの部分は、端をそっと押さえて、少しだけ平らにします。これで、良好なイメージングフレームが得られるはずです。

次に、組織を培地に浸して接着剤を硬化させます。接着剤が組織の上側に付着するのを防ぐため、組織を裏返しにし、まず角からゆっくりと培地のリザーバーに浸します。これにより組織がしっかりと固定され、組織イメージングチャンバー内で撮影することが可能になります。それでは、in situイメージング用に準備した脳組織の切片をステージにマウントします。

こちらが底面にシリコングリスを塗布した組織片です。これを培地の流れの中に静かに配置します。これで、シリコングレースによって組織がステージの底面に固定されました。温度プローブをすぐ隣に配置し、培地の流れを確認します。

それでは、ピント合わせを行います。フォーカス用の新しい光源、ブライトフィール照明を点灯します。20倍の対物レンズを使用し、チャンバー内へと下げていきます。

組織に触れないように注意してください。接眼レンズを覗き、耳組織に焦点を合わせます。そこにあります。

ここでは、ラットの耳の真皮層にある自発蛍光を持つ緑色の毛包が示されています。この毛包の周囲は、密なコラーゲン層で覆われています。Tエフェクターメモリー細胞のTフォトンのイメージングを行う際、我々はこの層を除去します。

自家蛍光を持つ毛包と、真皮上層の明るいコラーゲンが画像を妨げます。さて、ここではTexas red結合ボリンを取り込んだAPCが、これらの青いコラーゲン線維に沿って配置されているのがわかります。コラーゲン線維が青く見えるのは、コラーゲン線維に沿った2光子イメージングで得られる第二高調波発生によるものです。

T細胞は非常に高い運動性を持ち、コラーゲン繊維に沿って上下に移動しながらAPCと相互作用します。このビデオでは、Christine Beaton博士がルイスラットにおいて養子移行性DTHを誘導させる様子をご覧いただきました。

以上の通り、イメージングのための耳の前処理、反応性Tエフェクターメモリー細胞、ラットの耳、およびそれらを実施するための2光子技術について説明しました。