人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離
October 1st, 2008
ほとんどのアッセイは、単一セルの分解能が不足しているため脳組織の細胞の不均質性は、クロマチンにおけるエピジェネティックなマーキングの研究のための重大な制約をもたらす。ニューロンは通常、グリア細胞および他の非神経細胞が混在しています。私たちは、人間の脳から神経細胞核を抽出して収集するプロトコルを提供しています。
ヒトの脳におけるニューロン特異的遺伝子発現を支配するクロマチンDNA相互作用を研究するためには、まず純粋なニューロン核の集団を得る必要があります。死後、ヒト脳組織は均質化され、全核は密度勾配遠心分離を使用して単離されます。次に、フローメトリックソーティングによって単離されたニューロン特異的抗体で核を標識し、最後に超遠心分離で濃縮します。
こんにちは、私はマサチューセッツ大学医学部の精神科のシャロン・マク・バリアン博士の研究室のアニッシュ・マタンです。今日は、死後のヒト脳組織からニューロン核を分離する手順をお見せします。それでは始めましょう。
選別する各核サンプルについて、1,000ミリグラムの凍結死後脳組織から始めます。この量で、蛍光活性化選別後に約500万個の神経細胞核を得ることができます。核の抽出を開始するには、250ミリグラムの脳組織を5ミルの溶解バッファーを含むダウンダウナーに入れ、氷の上に置きます。
組織が氷の上で1分間解凍されると。ダウン後、均質化した組織を15ミルの透明な超遠心チューブに移し、チューブを氷の上に置きます。残りの組織に対してこの均質化を繰り返します。
次に、9ミルのスクロース溶液を超遠心チューブの底に慎重にピペットで移し、均質化された組織溶液がショ糖溶液の上にくるように濃度勾配を設定します。次に、超遠心チューブに重量を量り付けて、超遠心チューブのバランスが取れていることを確認します。最上層に溶解バッファーを追加して重量を調整します チューブの重量を量った後、SW 28ローター超遠心分離機のサンプルを107163.6 RCFで4度で2.5時間超遠心分離機に入れます。
遠心分離が完了したら、スナットと濃度勾配で見つかった破片の層を吸引します。核が入っているチューブの底にあるペレットを邪魔しないように注意してください。次に、各ペレットに500マイクロリットルの1つのXPBSを追加し、氷の上に20分間置きます。
20分後、ペレットをピペッティングで上下させて懸濁します。氷上でインキュベーションすると、ペレットが自然に少し溶けるため、核の再懸濁が容易になり、核が受けるストレスの量が軽減されます。次に、蘇生懸濁液と核を2つのミル遠心チューブに移します。
2本のウルトラセンテージチューブからの核溶液を各マイクロセントリファイチューブに結合し、再びサンプルを氷上に置きます。核抽出が完了したので、神経細胞核を単離するために免疫染色ステップに移ります 事実、核を含むサンプルを選別し、一次抗体と二次抗体からなる免疫染色混合物とインキュベートし、リンクをブロックして、1.2マイクロリットルのニューロン特異的抗体で免疫染色混合物を新しいNから1つのXPBSの300マイクロリットルに作製します。次に、1つのXPBSに0.5%BS、A、および10%のノーマルコード血清を含むブロッキングミックスを100マイクロリットル加えます。
最後に、LOR 4 88と呼ばれる二次抗体を1マイクロリットル追加します。また、この免疫染色混合物のネガティブコントロールサンプル用の免疫染色剤を調製します。一次抗体の新しい末端を除外し、1.2マイクロリットルの1つのXPBSと交換します。
次に、免疫染色混合物をボルテックスし、染色混合物をインキュベートしながら、暗所で室温で5分間インキュベートします。ネガティブコントロールサンプルEloqua 20マイクロリットルのレスサススパン核のコントロール核サンプルを、980マイクロリットルの1つのXPBSを含む2ミルチューブに調製します。また、核溶液とPBSのみを含む未染色のコントロールも調製します。
次に、Eloqua 20マイクロリットルの核を別のチューブに入れ、1つのXPBSで体積を1ミルまで上げます。次に、すべてのサンプルを氷の上に戻します。これで、免疫染色混合物は完成しています。
インキュベートしながら、401マイクロリットルの混合物を適切なサンプルに加えます。核サンプルは、新しいものとLOR4 88の両方を含む混合物を受け取りました。ネガティブコントロールサンプルは、二次抗体LOR 4 88のみを含有する混合物を受け取り、未染色のコントロールサンプルには免疫染色を添加しなかった。
次に、サンプルをcoldronに移し、暗所で45分間回転させます。45分間のインキュベーションが完了したので、サンプルをマサチューセッツ大学医学部フローサイトメトリーのコア施設に持って行き、蛍光活性化ソーティングを行います コア施設への輸送中、サンプルは氷上および暗闇に保管する必要があります。フローサイトメトリーのコア施設では、まずサンプルを40ミクロンのフィルターでろ過し、その後、冷たく保たれながら数分間装置に流します。
これは、ソートする前に予備データを取得するために行われます。未染色のコントロールは、負の蛍光の程度を確立します。この情報に基づいて、蛍光に対する機械の感度を調整します。
染色されたコントロールは、インフルエンザを制御するために使用されます。この時点での蛍光不足によるバックグラウンドノイズは、ソーティングに必要な適切なゲートを設定します。サンプルの選別には、いくつかの異なるゲートが使用されます。
最初のゲートの一般的なデータを次に示します。このファクス分析チャートは、ゲートを調整した後の代表的なサンプルを示しています。最初のゲートは、蛍光や一般的な視覚体験などの設定の組み合わせに基づいて、破片と生存可能な原子核のパターンを認識します。
x 軸は相対的なサイズに対応する前方散乱を表し、Y 軸は粒度などの内部の複雑さを説明するサイト散乱を表します。最初のゲートは、サンプル内にあるさまざまな核のサイズのアイデアを与えることもできます。これにより、デブリを実際の原子核から分離することができ、これが2番目のゲートからの典型的なデータです。
このファックスチャートは、凝集体を破棄しながら核を個別に選別できる第2ゲートの例を示しています。このゲートは、原子核がレーザーを通過するのにかかる時間の長さの違いを調べます。骨材であるものは、通常、通過するのに時間がかかります。
凝集体の包含は、一部の蛍光核が非蛍光核に結合する可能性があるため、純度を妨げる可能性があるため、この特定のパラメータは非常に重要です。最後に、3 番目のゲートの一般的なデータを次に示します。このゲートは、当社の二次抗体に含まれる蛍光ロンの蛍光波長と一致する特定の蛍光波長に設定されています。
このファックス チャートでは、X 軸に沿って蛍光レベルが表示され、Y 軸に沿って深赤色のチャネル検出器 PECY 7 が表示されています。これらのドットブロットは、単色のヒストグラムと比較すると、より優れたビジュアルを提供します。SCADAを配置することで、新しい正のニューロン核を新しい非ニューロン核と負の非ニューロン核から選別し、分離することができます。
すべてのゲートが選択されると、原子核は1つのXPBSにソートされます。サンプル全体がファクトソートを通過したら、機器を介してソートされたサンプルのEloquaを実行して、ソートの純度を確認します。最適な結果の例を次に示します。
ここでは、核の混合集団を含むプリソートサンプルと、負の核の大部分を排除した選別されたEloquaを比較します。純度のパーセンテージは、設定されたゲートに基づいてサンプルを汚染するイベントの数に基づいていることに注意してください。サンプルを初めて機械に通すときに、漂白が発生する可能性があるため、これを考慮して調光が発生する場合があり、いくつかの調整が必要になる場合があることに注意してください。
サンプルが選別されたら、核の処理を開始します。これを行うには、選別したサンプルを10ミル採取し、2ミルのショ糖溶液、50マイクロリットルの1モル塩化カルシウム、および30マイクロリットルの1モル酢酸マグネシウムを追加します。選別されたサンプルが10ミル未満の場合は、XPBSを1つ追加して容量を最大10ミルまで上げるか、それに応じて追加の材料を調整します。
次に、サンプルを数回反転させ、氷の上に15分間置きます。15分後、4度で15分間スイングバケットローター1、786 RCFでcentrif機能サンプル。遠心分離後、チューブの底にある白いペレットを乱さずに、上清を慎重に吸引します。
次に、ペレットを前の実験に必要な適切な溶液の200マイクロリットルに溶解します。この場合、ペレットとダウンバッファーを溶解して、その後のチップ実験に使用します。次に、ペレットをパイプで上下に再懸濁します。
この時点で、原子核を小さなチューブに移し、マイナス80°Cの冷凍庫に入れることができます。さらに使用するまで、ええと、私はちょうど人間の死後脳組織からニューロン核を分離する方法を示しました。この核を使用すると、クロマチン免疫沈降など、さまざまな分析を行うことができます。
この手順を実行するときは、核が固定されておらず、長時間で劣化する可能性があるため、サンプルを常に氷上に保管することを覚えておくことが重要です。また、バイオセーフティレベル2以上の安全基準でヒト組織を取り扱うことも重要です。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、死後の人間の脳組織から神経核を分離するためのプロトコルを提示し、脳研究における細胞の多様性によってもたらされる課題に対処しています。この方法により、神経細胞の遺伝子発現を制御するクロマチンDNAの相互作用の研究が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- エピジェネティクス
- 細胞生物学
背景
- 脳組織には神経細胞と非神経細胞が混在しています。
- ほとんどの検定は単一細胞レベルでのエピジェネティックマーキングを研究する解像度が不足しています。
- 純粋な神経核の分離は遺伝子発現を理解する上で重要です。
- この研究は、この分離を実現するための詳細なプロトコルを提供します。
研究の目的
- 人間の脳組織から純粋な神経核の集団を得ること。
- 神経細胞におけるクロマチン相互作用の研究を容易にすること。
- 神経特異的遺伝子発現メカニズムの理解を向上させること。
使用された方法
- 死後の人間の脳組織の均質化。
- 密度勾配遠心分離による総核の分離。
- 神経特異的抗体による核のラベリング。
- フローメトリクスによるソーティングと超遠心分離による濃縮。
主要な結果
- 神経核分離のための信頼性の高いプロトコルが確立されました。
- この方法により、神経細胞におけるクロマチン相互作用の研究が可能になります。
- 神経学的研究における遺伝子発現の理解への潜在的な応用。
- 脳組織におけるエピジェネティックマーキングの研究における解像度の向上。
結論
- このプロトコルは、神経核を特に研究する能力を向上させます。
- 脳組織における細胞の多様性によってもたらされる制限に対処します。
- この方法は、神経遺伝子発現とエピジェネティクスの研究を進歩させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating pure neuronal nuclei from heterogeneous brain tissue enables precise interrogation of chromatin dynamics and gene regulation mechanisms in neurons, addressing a critical limitation in neuropsychiatric and neurodegenerative target validation. This approach supports mechanistic de-risking by providing a disease-relevant system for epigenetic assays, improving predictive confidence in early discovery stages. The method facilitates translational biomarker identification and preclinical model development by enabling downstream applications such as ChIP-seq and DNA methylation analysis in a purified neuronal context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal-specific transcriptional and epigenetic landscapes to validate disease-associated targets.
- Operational Value: Reduces confounding signals from glial and non-neuronal cells, improving target specificity and hypothesis clarity.
- Scientific Value: Supports functional target validation by linking chromatin states to neuronal gene expression patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neuronal nuclei for chromatin-based assays including ChIP, ATAC-seq, and methylation profiling.
- Operational Value: Standardizes input material for epigenetic screening platforms, enhancing reproducibility across campaigns.
- Scientific Value: Enables quantitative, single-nucleus resolution readouts essential for assay sensitivity and hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant human neuronal system to assess target engagement and epigenetic modulation in postmortem tissue.
- Operational Value: Bridges discovery findings with preclinical validation by maintaining neuronal identity across experimental workflows.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through direct assessment of chromatin modifications in human neurons.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through mechanistic interrogation of neuronal chromatin states prior to lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of neuronal gene regulation pathways by isolating nuclei for downstream omics applications.
- Screening: Delivers standardized, purified neuronal nuclei suitable for high-content epigenetic screening assays.
- Analytics: Generates quantitative chromatin and DNA modification readouts that inform target prioritization and structure-activity relationships.
- Translational Research: Connects epigenetic discoveries in human neurons to preclinical models via conserved regulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal nuclei isolation platform applicable across multiple brain regions and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing biological noise from cellular heterogeneity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of neuronal chromatin assays through standardized isolation and sorting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing mechanistic insight into neuronal target biology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of epigenetic and gene regulation targets with stronger human relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, epigenetics, and flow cytometry for proper execution and interpretation.
- Dependent on access to ultracentrifugation, fluorescence-activated cell sorting, and antibody validation infrastructure.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure consistency in nuclei yield and purity.
- Must account for postmortem interval and tissue preservation status when applying to diverse donor cohorts.
- Limited to unfixed tissue applications; not compatible with formalin-fixed or paraffin-embedded samples.
