人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離

ヒト脳におけるニューロン特異的な遺伝子発現を制御するクロマチンDNA相互作用を研究するためには、まずニューロン核の純粋な集団を得る必要があります。死後ヒト脳組織をホモジナイズし、密度勾配遠心法を用いて全核を単離します。次に、ニューロン特異的抗体で核を標識し、フローサイトメトリーによるソーティングで単離し、最終的に超遠心分離によって濃縮します。

こんにちは。私はマサチューセッツ大学医学部精神科のSharon mc Barian博士の研究室に所属しているAnish Matanです。今日は、死後ヒト脳組織から神経細胞核を単離する手順について説明します。それでは始めましょう。

分取を行う各核サンプルについて、1,000 mgの凍結死後脳組織から開始します。この量により、蛍光活性化分取後に約500万個の神経細胞核を得ることができます。核抽出を開始するには、250 mgの脳組織を5 mLの溶解バッファーを含むダウンチューブに入れ、氷上に置きます。

組織を解凍した後、氷上で1分間ホモジナイズします。ホモジナイズ後、均質化した組織を15 mLの透明な超遠心管に移し、管を氷上に置きます。残りの組織についても、同様にホモジナイズを繰り返します。

次に、サクロース溶液 9 mL を超遠心管の底に慎重にピペッティングし、均質化された組織溶液がサクロース溶液の上に位置するように濃度勾配を形成します。次に、超遠心分離中にバランスが保たれるよう、超遠心管の重量を量ります。重量の調整が必要な場合は、最上層に溶解バッファーを加えて調整してください。重量を量った後、チューブを超遠心機にセットし、SW 28 ローターを用いて 107,163.6 RCF、4 °C で 2.5 時間、超遠心分離を行います。

遠心分離が完了したら、上清および濃度勾配に認められるデブリ層を吸引して取り除きます。チューブ底部にある核を含むペレットを乱さないように注意してください。次に、各ペレットに500 µLの1×PBSを加え、氷上で20分間静置します。

20分後、ピペッティングによってペレットを再懸濁します。氷上でのインキュベーションにより、ペレットが自然に少し溶解するため、核の再懸濁が容易になり、核へのストレスを軽減することができます。その後、再懸濁した核を2 mL遠心チューブに移します。

2本の超遠心チューブから核酸溶液を回収し、それぞれのマイクロ遠心チューブに合わせ、再びサンプルを氷上に置きます。核酸抽出が完了しましたので、次に、FACsソートによって神経細胞核を単離するための免疫染色のステップに移ります。核を含むサンプルを、一次抗体と二次抗体、およびブロッキング剤からなる免疫染色混合液とともにインキュベートします。免疫染色混合液を作成するために、1X PBS 300 µLに神経細胞特異的抗体 NeuN を1.2 µL加えます。その後、0.5% BSAと10%正常ヤギ血清を含む1X PBSのブロッキング剤100 µLを加えます。

最後に、LOR 4 88と呼ばれる二次抗体を1 µL加えます。また、この免疫染色混合液を用いて、陰性対照サンプルのための免疫染色試料を調製します。一次抗体を加えずに、代わりに1X PBSを1.2 µL加えます。

次に、免疫染色の混合液をボルテックスで撹拌し、遮光した室温条件下で5分間インキュベートします。インキュベートしている間に、陰性対照試料としてコントロール核サンプルを調製します。再懸濁した核溶液20 µLを、1×PBS 980 µLを含む2 mLチューブに分注します。また、核溶液とPBSのみを含む、非染色コントロールも調製します。

次に、核懸濁液 20 µL を別のチューブに移し、1×PBS を加えて液量を 1 mL に戻します。その後、すべてのサンプルを再び氷上に置きます。これで、免疫染色混合液の準備が完了します。

混合液401 µLを適切なサンプルに加えます。核サンプルには、newおよびLOR 4 88の両方を含む混合液を加えました。陰性対照サンプルには二次抗体LOR 4 88のみを含む混合液を加え、未染色対照サンプルには免疫染色の試薬を一切加えませんでした。

次に、サンプルをコールドロンに移し、暗所で45分間回転させます。45分間のインキュベーションが完了したので、サンプルをマサチューセッツ大学医学部のフローサイトメトリーコアファシリティに運び、蛍光活性化セルソート（FACS）を行います。コアファシリティへの輸送中、サンプルは氷上で遮光状態で保持する必要があります。フローサイトメトリーコアファシリティでは、まずサンプルを40 micronフィルターでろ過し、その後、冷却状態を維持しながら数分間装置に通します。

これは、ソートを行う前に予備データを取得するために行われます。未染色のコントロールにより、陰性蛍光の程度を確定させます。この情報に基づいて、装置の蛍光感度を調整してください。

染色コントロールは、蛍光を制御するために使用されます。この時点で、蛍光によるバックグラウンドノイズを確認し、ソーティングに必要な適切なゲートを設定します。サンプルのソーティングには、いくつかの異なるゲートが使用されます。

以下は、最初のゲートに関する代表的なデータです。このFAX解析チャートは、ゲート調整後の代表的なサンプルを示しています。最初のゲートでは、蛍光などの設定の組み合わせおよび一般的な視覚的経験に基づき、デブリと生存核のパターンを識別します。

x軸は前方散乱光（forward scatter）を表し、これは相対的なサイズに対応します。一方、y軸は側方散乱光（side scatter）を表し、顆粒度などの内部複雑性を反映します。最初のゲートにより、サンプル内に存在する異なる核のサイズを把握することも可能です。これにより、デブリと実際の核を分離でき、ここでは2番目のゲートから得られた代表的なデータを示します。

このファックスチャートは、凝集物を排除しながら核を個別にソートすることを可能にする、2番目のゲートの例を示しています。このゲートでは、核がレーザーを通過するのにかかる時間の差を確認します。通常、凝集したものは通過に時間がかかります。

凝集体の混入は、一部の蛍光核が非蛍光核に結合している可能性があるため、純度に影響を及ぼすことがあり、このパラメータは非常に重要です。最後に、3番目のゲートの代表的なデータを示します。このゲートは、二次抗体に含まれるフルオロフォアの蛍光波長に合わせて設定されています。

このファックスチャートでは、x軸に蛍光レベルを、y軸に深赤色チャンネル検出器のPECY 7を示しています。これらのドットプロットは、単色のヒストグラムと比較して、より優れた視覚的判断を可能にします。SCADAを配置することで、Neu+かつ陽性のニューロン核を、Neu-かつ陰性の非ニューロン核から分取・分離させることができます。

すべてのゲートを選択した後、核を1つのXPBSに分取します。サンプル全体がソートにかけられた後、分取したサンプルのEloquaを装置で解析し、ソートの純度を確認してください。以下に最適結果の例を示します。

ここでは、核の混合集団を含むソート前のサンプルと、陰性核の大部分が除去されたソート後のEloquaを比較します。純度（%）は、設定したゲートに基づいてサンプルに混入しているイベント数に基づいていることに注意してください。サンプルを最初に装置に通した際に、一部で退色が生じ、それに伴い輝度が低下する場合があるため、必要に応じて調整を行ってください。

サンプルのソートが完了したら、核の処理を開始します。まず、ソート済みサンプルを10 µL取り、そこにショ糖溶液2 µL、1 M塩化カルシウム50 µL、および1 M酢酸マグネシウム30 µLを加えます。ソート済みサンプルが10 µL未満の場合は、1×PBSを加えて容量を10 µLにするか、あるいは添加する各試薬の量を適切に調整してください。

次に、サンプルを数回反転混和し、氷上で15分間静置します。15分後、スイングバケットローターを用いて、4°Cで1,786 RCFで15分間遠心分離します。遠心分離後、チューブの底にある白いペレットを乱さないように注意しながら、上清を慎重に吸引除去します。

次に、ペレットを前述の実験に必要な適切な溶液 200 µL で溶解させます。今回は、後続のチップ実験に向けて、ペレットを溶解バッファーで溶解させます。その後、ピペッティングによりペレットを再懸濁します。

この時点で、核をより小さなチューブに移し、-80 °Cのフリーザーに保存することができます。これで、ヒト死後脳組織から神経細胞核を単離する方法について説明しました。これらの核を用いて、クロマチン免疫共沈降法などのさまざまな解析を行うことが可能です。

この手順を行う際は、核が固定されておらず、高温で分解する可能性があるため、常にサンプルを氷上で保持することが重要です。また、ヒト組織はバイオセーフティレベル2以上の安全基準に従って取り扱う必要があります。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。