光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

Dowling研究室では、ゼブラフィッシュの網膜の生理学および発生について研究しており、運動を検出できないゼブラフィッシュの変異体が、光を検出でき、盲目ではないかどうかを明らかにすることを目指しています。これを検証するために、視覚運動反応（VMR）をテストします。ゼブラフィッシュは受精後約4日で回収します。

それらを96ウェルプレートに配置し、適切なイメージング装置を準備してビデオトラッキングソフトウェアをプレートに合わせ、明から暗、または暗から明への移行後の魚の運動反応を追跡します。これをVMRと呼びます。こんにちは、ハーバード大学分子細胞生物学部、ジョン・ダウリング研究室のファリダ・イムランです。

私はジェイソン・リオです。ハーバード大学の分子細胞生物学部門にあるアレクサンダー・シア研究室に所属しています。本日は、光の増減に対するゼブラフィッシュの視覚運動反応について解説します。

それでは始めていきましょう。視覚運動反応アッセイを開始するために、まず野生型ゼブラフィッシュの胚を28 °Cの明暗サイクル下で、受精後少なくとも4日目まで育成します。最適な行動結果を得るための一般的な明暗サイクルは、午前9時から14時間の点灯、午後11時から10時間の消灯としています。

幼魚が高密度になりすぎないように注意してください。通常、1枚のペトリ皿につき50匹以下の幼魚で飼育します。受精から5日後、幼魚が十分に泳げるスペースを確保するため、ゼブラフィッシュをウェルサイズ650 µLの96ウェルプレートに移します。

プラスチック製転送ピペットを用いて、ウェルあたり1匹の幼魚を慎重に移動させます。魚をウェルに移動させた後、水面がウェルの上端とほぼ同じ高さになるまで、各ウェルに十分な魚用水を満たします。記録用カメラの光学的な問題を防ぐため、ウェルへの注水量が多すぎたり少なすぎたりしないよう注意してください。

また、ウェル内に気泡が入らないように注意してください。これで、光と暗に対する魚の運動反応を観察する準備が整いました。プレートに配置したゼブラフィッシュを記録装置まで運びましょう。

それでは、記録装置について概観していきましょう。魚が入った96ウェルプレートを、こちらの白いトレイにある記録チャンバー内に配置し、スプリングまたはゴムバンドで固定します。カメラはこちらのボックスの背面に配置されており、ここにあるボックス上部のミラーを使用してプレートに焦点を合わせています。

これらのミラーの角度は、ミラーを固定しているネジを回すことで調整できます。記録チャンバーは底部から赤外線LEDによって照らされます。これにより、暗所においてもカメラで魚を記録することが可能です。

幼虫は赤外線（IR）を検知できないため、この持続的なIR照射は実験に影響を与えません。また、白色LEDによって記録チャンバーの下方からも照明が行われます。数時間以上にわたって実施される実験の場合、白色LEDはIRライトとは別に制御されます。

実験期間中、温度を一定に保つために、チャンバー内に緩やかに水を流して満たすことができます。水は小型の水槽用ポンプによってリザーバーから送られ、一般的な水槽用水中ヒーターで28 °Cに加熱されます。水は大きな排水口から排出され、室内の不要な振動を最小限に抑えるためにリザーバーへ再循環されます。

記録ユニット全体を重量バランステーブルの上に設置します。記録装置の準備が整ったら、ボックスの蓋で動物を覆い、光からさらに遮断します。それでは、96の調整に進みましょう。

ビデオトラッキングソフトウェアのコンピューターグリッドに合わせて、魚が入った96ウェルプレートを記録チャンバーに設置します。長期実験のためにウォーターバスを使用する場合は、プレートに水がこぼれないよう、水位を調整しながらゆっくりとプレートを水に入れます。ViewPointビデオトラッキングソフトウェアで、すべての稚魚と実験範囲がコンピューター画面に表示されていることを確認してください。

ソフトウェアのコントロールを使用して、ビデオトラッキングソフトウェアのグリッドを96ウェルプレートのウェルに合わせて、各個体がグリッドの正方形の中に収まるように調整します。この手順は、すべての記録において非常に重要です。トラッキングコンピュータは、これらのボックスごとに個別に移動を計算します。

したがって、コンピューター上のグリッドの配置を誤ると、魚の動きの一部が失われたり、さらに悪い場合には、隣接する2匹の魚が同じエリアに配置され、アライメント後に1匹としてカウントされたりする可能性があります。照明のオン・オフのタイミングは、コンピューターにプログラムされています。

通常、ボックス内で3時間の緩やかな暗順応を行います。これにより、ベースラインの活動レベルを得られるだけでなく、ピぺッティングやハンドリング後の幼虫を落ち着かせることができます。次に、記録チャンバーのドアを閉め、記録を開始します。

実際には、魚1匹あたりの活動を1秒単位で記録していますが、ビューポイントソフトウェアでは実際にはフレームごとのデータを記録しています。以下に、魚1匹のリアルタイムトレース画面を示します。ピクセル移動に関して、白線はピクセル変化数が設定しきい値を下回っていることを示し、緑線はピクセル変化がしきい値設定を上回っていることを示しています。

閾値は、使用するカメラや照明の設定によって多少異なります。本セットアップでは、通常4ピクセルの閾値を使用しています。つまり、変化しているピクセルが4ピクセル未満である場合は、背景であるとみなされます。

4ピクセルを超えて移動している場合は、魚が移動していることを示します。このカットオフ値を採用することで、幼魚の泳ぎや旋回動作のほぼすべてを検出できることを経験的に決定しました。録画ボックスによって幼魚はかなりうまく隔離されていますが、それでも室内の照明を消し、室内のドアの開閉や、ダンスパーティー、エクササイズなどの機械的なノイズによる妨げを最小限に抑えるよう注意を払います。

実験完了後、収集したデータをExcelシートまたは任意の解析ソフトウェアに転送します。これがデータの形式です。ここには、実験開始からの時間（秒）と、1秒あたりの各幼虫の活動量が記録されています。

ここでは、実験期間全体における単一の幼魚の活動を示すグラフを提示します。グラフ上の矢印は、いくつかのオンおよびオフ反応を示しています。このグラフは、実験期間全体における魚40匹の平均活動を示しており、矢印で示されているように、いくつかのオンおよびオフ反応が認められます。見ての通り、オンおよびオフ反応は顕著かつ一貫しています。

この視覚運動反応実験は、変異魚を用いて行うことも可能です。これらの研究では、最適な対照を設けるため、通常、野生型魚と変異魚を同一プレート上にチェッカーボード状に配置します。同一プレートに野生型魚と変異魚を混在させて使用する場合は、各ウェルにどのタイプの魚を配置したかを必ず記録してください。

各ウェルに分注した魚を追跡する方法について提案します。さて、こちらが野生型と変異型の幼魚を比較した視覚運動反応の結果です。ここでも、野生型幼魚からは顕著かつ一貫したオン・オフ反応が見られます。

しかしながら、眼の発達を欠くchalk変異体幼虫は、光の増加または減少のいずれに対しても活動性を有意に増加させず、ベースラインの活動レベルも低くなります。これらの結果は、野生型の反応を、NRC変異体とも呼ばれるNO OKR変異体と比較したものです。NRC変異体は、OKRテストに基づき、完全に盲目であると考えられていました。

VMRテストを用いて、NRC変異体は正常なオフ応答を示す一方で、オン応答は遅延し緩慢であることを実証します。したがって、NRC変異体は以前に考えられていたように完全に盲目であるわけではありません。ここまで、光の増減に対するゼブラフィッシュlabateの視覚運動反応について説明しました。

本手順を行う際は、魚は夜間よりも日中の方が活動的であり、光強度の変化に対する反応も良いため、実験を日中に行うことが重要であるという点に留意してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。