Name: メチル化DNA免疫沈降 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: 学ぶメチル化DNA免疫沈降法（MeDIP）を用いたエピジェネティクス研究の手法。このプロトコルは5-メチルシトシン抗体を使用してメチル化DNAを選択的に抽出し、がんや遺伝子発現制御の研究に応用できます。

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我々は、このビデオと記事を批評への参加のためにブラウンとラムラボのメンバーに感謝したい。この作品は、健康研究と健康研究のためのマイケルスミス財団のためのカナダの協会からの資金によって支えられている。

DNAの抽出および検体の調製異なるさまざまなサンプル（培養細胞、新鮮なだけでなく、ホルマリン固定パラフィン包埋組織として冷凍）からDNAをMeDIPに使用することができます。このようなヒストンなどの関連蛋白質することなく、高度に精製されたDNAを使用することが重要です。それはDNAの定量と抗​​体の結合の両方を妨げることができるように、試料からできるだけ多くのRNAを除去することも重要です。 MeDIPのために使用されるDNAの量は200 ngから利用可能なDNAの量に応じて、1μgの範囲で指定できます。このプロトコルを示すために、1μgのDNAが使用されます。以下のプロトコールは、培養細胞から高品質の二本鎖DNAを提供します。他のプロトコルは、他の種類のサンプルからDNAの抽出に使用されるべきである。 <ol><li> 1.7ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ中で細胞ペレットに消化緩衝液400μlを添加します。 </li><li>チューブにプロテイナーゼKの100μgを追加し、50℃一晩インキュベート℃、 </li><li> 500μlのフェノールのpH 7を追加し、反転によって穏やかに混和する。 </li><li>室温で10分間13,000 gでスピン。 </li><li>新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。 </li><li>繰り返します一度3〜5を繰り返します。 </li><li> 500μlの1時01フェノール/クロロホルムpHが7を追加し、反転によって穏やかに混和する。 </li><li>室温で10分間13,000 gでスピン。 </li><li>新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。 </li><li> RNase Aを40μgを追加し、37℃で1時間のインキュベート℃に</li><li> 500μlのフェノールのpH 7を追加し、反転によって穏やかに混和する。 </li><li>室温で10分間13,000 gでスピン。 </li><li>新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。 </li><li>繰り返しは、かつて11〜13を繰り返します。 </li><li> 500μlの1時01フェノール/クロロホルムpHが7を追加し、反転によって穏やかに混和する。 </li><li>室温で10分間13,000 gでスピン。 </li><li>新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。 </li><li>の3 M酢酸ナトリウム（40μl）を10分の1の体積を加え、よく混ぜる。 </li><li> 100％エタノールの2倍量（900μl）を追加し、20分、-20 ° Cでよく混ぜ、そして場所。 </li><li> 4℃で20分間13,000 gでスピン℃、 </li><li>エタノールを削除する、パルスのスピン、そして残留エタノールを除去します。 </li><li>洗浄に500μlの冷70％エタノールを加えます。 4℃で20分間13,000 gでスピン℃、 </li><li> 70％エタノール、パルスのスピンを削除し、ピペッティングにより残留エタノールを除去します。 </li><li>空気が残留エタノールの痕跡をすべて削除するには、室温で10分のためのオープンキャップでペレットを乾燥させます。 </li><li> 4℃で一晩滅菌dH2Oの50μlの再懸濁し、DNA℃の</li><li>光度計分光光度計を用いてDNAを定量化する。 260：1.8の280比率が理想的です。 </li><li> 100 bpのラダーをアガロースゲル上でDNAの品質とサイズの範囲を決定します。ゲノムDNAのわずか10 ngのは、SYBRゴールドのようなDNAの少量に非常に敏感な色素を用いて染色を1.7パーセントアガロースゲル上で実行することができます。 </li><li>サンプルごとにシリコン処理したチューブに、滅菌のdH 2 Oで構成されたボリュームの残りの50μlの合計体積で1μgのDNAを準備する</li></ol> DNA超音波処理 DNAの超音波処理とMeDIPのプロトコルは、管壁へのタンパク質の非特異的結合を防ぐためにsiliconziedチューブで実行する必要があります。 DNAサンプル用に最適な超音波処理時間は、ゲル電気泳動（ステップ27）から決定されたDNAサンプルの断片化の程度に基づいています。例えば、培養細胞から抽出したDNAは非常に高分子量でなければならない、と続いて、しばしば部分的に分解されるアーカイブのサンプルから抽出したDNAよりも多くの超音波処理が必要になります。サンプルが均一に高分子量のものであるなら、それは個別に各サンプルを確認することなく、このプロトコルで説明されているように超音波処理を続行するには、この時点で合理的です。サンプルはアーカイブのサンプルと同様に断片化されている場合、それは300 - 100ベーシスポイントのフラグメントを得るために超音波処理時間を減少させることによって可能性が高い超音波処理の手順を適応させるために必要となります。あなたが部分的に分解されているサンプルを処理することが予想される場合は、超音波処理パラメータの最適化は重要なものから代表的なサンプルで実行することができます。ゲル電気泳動（ステップ27）から観測されたDNA断片化の程度に基づいて、実験者はサンプルのために最適な超音波処理の時間を事前に決定することができます。ここでは、高分子量のDNAを用いて自動化された超音波処理装置（DiagenodeのBioruptor、UCD - 200 TM）と超音波処理によって約300〜1,000 bpのDNA断片を取得する方法を説明します。 <ol><li> Biorupterの水は4でなければなりません℃に</li><li>自動設定で7分（30秒、最大パワーで30秒オン、オフ）のために超音波処理。 </li><li>免疫沈降（IP）反応のためにシリコーン1.7ミリリットルの遠心管に超音波処理した製品や場所、800 ngの（40μl）を取り外します。 </li><li>入力として機能するように、残りの200 ngの（10μl）を（IN）（4℃で保存）リファレンスDNAを脇に置きます。 </LI&gt; </ol>メチル化DNAのIMMUNOPRECIPITATON <ol><li>水浴中で10分間95℃でIP反応（800 ng）のために使用されるDNAを変性させる。 </li><li>氷上で直ちに冷却してください。次のステップに進む前に（氷の上で約5分）完全にDNAを冷ます。 </li><li> 5μgのモノクローナル抗体を追加。 </li><li> 500μlの最終容量にIPバッファを（このプロトコルを通じて、室温で使用される）を追加します。 </li><li>チューブホルダーを回転で4で2時間℃でインキュベートする。 </li><li>手順5が完了する直前に、（ステップ6-11）洗浄してダイナビーズを準備。最初に、ボルテックスでバイアルに徹底的にビーズを懸濁します。 </li><li>新しいシリコーンチューブ（例えば、8の反応を行う場合、9の十分なビーズを除去する、すなわち、270μL）に、反応プラス1あたりの再懸濁したダイナビーズ30μlを（〜2 × 10 7）転送する。 </li><li>室温で2分のための磁気ラック上にチューブを置きます。 </li><li>上清をピペットで。上清を除去する際、ピペットの先端で内部の壁（ビーズが磁石に引き付けている）に対して、ビーズには手を触れないでください。 </li><li>磁石からチューブを外し、IPバッファの過剰量（750μlの- 1000μL）でビーズを再懸濁します。バック室温で2分のための磁気ラック上にチューブを置きます。 </li><li>一回以上の洗浄を繰り返し、次にステップ7で取り外した元のボリュームにIPバッファーで洗浄したビーズを再懸濁します。 </li><li>各IP反応液に洗浄ダイナビーズ30μlを追加する</li><li> 4℃で2時間回転管ホルダー℃でインキュベートする</li><li>インキュベーションが完了した後、室温で2分のための磁気ラック上にチューブを置きます。 </li><li>上清をピペットで。ピペットの先端でチューブの内壁を（ビーズが磁石に引き付け場所）には触れないでください。 IP緩衝液500μlを追加。チューブの内容物を混合し、2分のための磁気ラックに戻す。 500μlのIPバッファーで1回洗浄繰り返します。 </li><li>最後の洗浄上清を除去した後、消化バッファ400μlでビーズを再懸濁します。 </li><li>プロテイナーゼK100μgのとの反応を治療し、50℃で一晩インキュベート℃、 </li></ol>免疫沈降したDNAの精製<ol><li> 500μlの1時01フェノール/クロロホルムpHを7と完全にボルテックスを追加。 </li><li>室温で10分間13,000 gでスピン。 </li><li>新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。 </li><li>水溶液と有機層との間の相間が曇って表示されている場合は手順1〜3を繰り返します。 </li><li> 1 / 10量の3 M酢酸ナトリウム（40μl）を、ボルテックスを追加。 </li><li> 1グリコーゲンの溶液（20μg/μLの）と渦を追加。 </li><li> 100％エタノール、渦、および20分まで-20℃での場所の2倍量（1000μL）を追加します。 </li><li> 4℃で20分間13,000 gでスピン℃、 </li><li>エタノールを削除する、パルスのスピン、そして残留エタノールを除去します。 </li><li>洗浄に500μlの冷70％エタノールを加えます。 4℃で20分間13,000 gで軽くボルテックスし、そしてスピン℃に</li><li> 70％エタノール、パルスのスピンを削除し、ピペッティングにより残留エタノールを除去します。 </li><li>空気が残留エタノールの痕跡をすべて削除するには、室温で10分のためのオープンキャップでペレットを乾燥させます。 </li><li>のdH 2 0滅菌10μlに再懸DNAペレット。 </li></ol> PCRによる検証<ol><li>あなたのMeDIPの手順は通常のヒトDNAを（男性または女性）を使用してMeDIPのプロトコルを実行することにより、ワーキング、その後、メチル化に富むことが知られている地域をアッセイしていることを確認するためにテストすることができます。 </li><li> PCRチューブにMeDIPの製品の30％、および他のPCRチューブにMeDIP製品の別の30％を削除します。 </li><li> PCRチューブにDNAの10ngの、および他のPCRチューブにDNA中の10 ngを置く。これで、4つの別々のPCR反応をセットアップする必要があります。 </li><li> PCRは、H19とCTRLプライマーを用いて行うには、表1に示した。 </li><li>表2に示すように12.5μL、総体積とのPCR反応の2つのmastermixes（各プライマーセットで1つずつ）を用意。 </li><li>表3に記載された条件を用いてPCRをThermocycle。 </li><li>可視化のための2％アガロースゲルでPCR産物の5μlを実行します。 </li><li>成功MeDIPの予想結果を表4に示す。 </li></ol>テーブル表1：H19とPCRの検証のためにCTRLプライマー。 <table border="1"><tbody><tr><td>プライマーセット</td><td>フォワードプライマー</td><td>リバースプライマー</td><td>予想される製品のサイズ</td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39; - cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39; - ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 bpの</td></tr><tr><td> CTRL（コントロール） </td><td> CTRL_F5&#39; - gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39; - gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 bpの</td></tr></tbody></table>表2。 PCR反応のMastermixes。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19ミックス（あたりRXN） </td><td> CTRLミックス（あたりRXN） </td></tr><tr><tD&gt;のddH 2 O </td><td> 6.875 </td><td> 6.875 </td></tr><tr><td> 10Xバッファー</td><td> 1.25 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> dNTPミックス（10 mMの各） </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（50mMの） </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td>プライマー（H19_F / RまたはCTRL_F / R）（10μMの各F / R） </td><td> 0.625 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td>プラチナTaqポリメラーゼ</td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table>表3。 PCR thermocyling条件。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 5時00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 0時30分</td></tr><tr><td> 56℃ </td><td> 0時30分</td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 0時15分</td></tr></tbody></table>表4。成功MeDIPのPCRの結果を期待。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center">テンプレートDNA </td></tr><tr><td>使用するプライマー</td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td>正</td><td>正</td></tr><tr><td> CTRL </td><td>正</td><td>マイナス</td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
<li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> Development. 134, 3959-3965 (2007).</li>
<li>Feinberg, A. P., Tycko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+cancer+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">The history of cancer epigenetics.</a> Nature reviews. 4, 143-153 (2004).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 457-466 (2007).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
<li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics%3A+mapping+the+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epigenomics: mapping the methylome.</a> Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).</li>
<li>Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elaborate+pathway+required+for+Ras-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing.</a> Nature. 449, 1073-1077 (2007).</li>
<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+relations+to+disease+and+laboratory+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: relations to disease and laboratory findings.</a> Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).</li>
<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

疾患において重要な役割のDNAメチル化の戯曲の認識が広がりつつあります、この修正を測定するアッセイのため、開発は13、12、3重要性を増してきています。 MeDIP技術は、全ゲノムと遺伝子座特異的レベル6、7の両方でのスクリーニングのための従順なツールです。この手法は、DNAを始めるの限られた量を使用してDNAのメチル化レベルの急速なビューを提供し、異なるソース間で容易に比較することができます。 MeDIPの製品を使用して、ダウンストリームのアプリケーションは、そのような全ゲノムおよびCpGアイランドのオリゴヌクレオチドの配列としてマイクロアレイの様々な、興味のある遺伝子座の直接PCRアッセイだけでなく、シーケンシングなどがあります。 MeDIPはメチル化とDNA 6を非メチル化を区別する抗体に依存しているDNAのメチル化の検出に異なるアプローチを提供します。 MeDIPは従来の亜硫酸塩シークエンシングの手法よりも高速であり、それは制限酵素分析のような特異的な配列の解析に限定されないが、免疫沈降は、CpG密度、反復...

<table><tbody><tr><td>Biorupter ソニケーター</td><td>器具</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>1.7ml SafeSeal マイクロ遠心チューブ</td><td>その他</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>ND 3300 分光光度計</td><td>器具</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次抗体：Anti-5&amp;rsquo;-methylcytosine マウス mAb</td><td>試薬</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体：Dynabeads M-280 ヒツジ抗マウス IgG</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>磁気チューブラック</td><td>器具</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>器具</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>IP バッファー</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100。室温で保存</td></tr><tr><td>消化バッファー</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

メチル化dna免疫沈降

Methylated DNA Immunoprecipitation

DNAのメチル化パターンの識別には、メチル化が遺伝子発現に大きな影響を持つことが知られているように、エピジェネティクスの研究では一般的な手順であり、通常の開発だけでなく、病気に関与している<sup&gt; 1月4日</sup&gt;。従って、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する能力は、そのような研究のためにメチル化プロファイルを生成するために不可欠です。メチル化DNA免疫沈降（MeDIPは）興味のサンプルからのメチル化DNAの抽出のための効率的な手法です。<sup&gt; 5月7日</sup&gt;。 DNAのようにわずか200 ngのサンプルは、抗体、または免疫沈降（IP）、反応に十分です。 DNAは、約300〜1,000 bpからサイズの範囲のフラグメントに超音波処理され、そして免疫沈降（IP）と入力（IN）部分に分かれています。 IPのDNAは、その後、熱変性し、モノクローナル抗体は、メチル化DNAを結合させること、抗5&#39;mCとインキュベートされる。この後、一次抗体に対する親和性を有する二次抗体を含む磁性ビーズを添加し、インキュベートする。これらのビーズにリンクされた抗体は、最初のステップで使用されるモノクローナル抗体をバインドします。抗体複合体（メチル化DNA）に結合したDNA溶液から複合体を引き出すために磁石を使用してDNAの残りの部分から分離されている。 IPバッファを使用して数回の洗浄が結合していない、非メチル化DNAを除去するために実行されます。メチル化DNA /抗体複合体は、唯一のメチル化DNAをそのまま残し抗体を消化するためにプロテイナーゼKで消化されています。蛋白質の物質を除去するためにクロロホルム抽出し、後で使用するために沈殿し、水に再懸濁さ：濃縮されたDNAは、フェノールによって精製する。 PCR技術は、IPの増幅産物を分析することにより、地域の欠如に知られているとメチル化配列を含むように知られているため、DNAのMeDIPの手順の効率性を検証するために使用することができます。精製したメチル化DNAは、遺伝子座特異的（PCR）またはゲノムワイド（マイクロアレイやシーケンシング）メチル化の研究に使用し、そのような遺伝子発現プロファイリングとアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションなどの他の研究ツールと組み合わせて適用する場合に特に有用であることができる（ CGH）<sup&gt; 8</sup&gt;。 DNAメチル化へのさらなる調査は、順番に、異常にメチル化DNAを特徴とする、癌などの疾患の新しい治療や予後の研究ツールの開発に便利だと思われる、新たなエピジェネティックなターゲットの発見につながる<sup&gt; 2、4、9-11</sup&gt;。

このビデオでは、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）のためのプロトコルを示しています。 MeDIPは、選択的に5 - メチルシトシン（抗- 5 MC）のための特異性を有する抗体を用いてゲノムDNAのサンプルからメチル化DNA断片を抽出する二日間の手順です。

メチル化DNA免疫沈降

DNAメチル化パターンの同定は、エピジェネティクス研究において一般的な手順である。なぜなら、メチル化は...に重大な影響を及ぼすことが知られているためである。

このビデオでは、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）のプロトコルを実演します。これは、メチル化DNAをバイアスのない方法で特異的に単離するために用いられる手法です。哺乳類におけるDNAメチル化は、シトシンのC5位へのメチル基の付加によって特徴付けられます。CpGジヌクレオチドに存在するDNAメチル化は、正常な発生およびいくつかの疾患プロセスにおいて重要な役割を果たす可逆的なエピジェネティックマークです。DNAメチル化の正常な機能には、女性におけるX染色体の不活性化、反復配列のサイレンシング、ゲノムインプリンティング、およびゲノム安定性の維持が含まれます。また、DNAメチル化は、癌、de Willebrandt-Callaman症候群、エンゲルマン症候群、免疫不全・セントロメア不安定性・顔面異常症などの数多くの疾患においても役割を果たすことが示されています。例えばがんにおいて、プロモーターの異常な高メチル化は、重要ながん抑制遺伝子のサイレンシングを引き起こす可能性があります。一方で、不適切な低メチル化は染色体の不安定化や癌遺伝子の活性化を招きます。まず、DNAを300から1000塩基対のサイズの断片に超音波破砕することで処理を行います。次いで、超音波破砕したDNAを95°Cで変性させます。5-メチルシトシンを認識する一次抗体を添加し、メチル化されたDNA断片に結合させます。磁性ダイナビーズに結合させた二次抗体を用いて、一次抗体が結合したDNA断片を単離します。非メチル化断片を除去し、プロテイナーゼで抗体を消化します。KAフェニルクロロホルムによるクリーンアップで消化されたタンパク質を除去し、沈殿させることでDNAを精製します。これにより、メチル化断片が濃縮されます。精製後のDNAは、PCRマイクロアレイやシーケンシングなどのアプリケーションに使用できます。通常、この工程は2日間の手順として行われます。1日目は、DNA調製、超音波処理による免疫沈降、およびタンパク質消化を行います。2日目は、メチル化濃縮DNAを精製および単離するため、pHクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行います。準備には、シリコン処理済み遠心チューブ、DNA超音波処理装置、一次抗体（抗5-メチルシトシンマウスモノクローナル抗体）、二次抗体（羊抗マウスIgG結合ダイナビーズ）、およびマグネティックチューブラックなどの特殊な材料が必要です。Meetupプロトコルの最初のステップは、DNAの調製です。事前にDNAの性質を評価することが不可欠です。サンプルの正確な定量は極めて重要であり、DNA量を決定するさまざまな方法は、望ましくないDNA種の存在によって悪影響を受ける可能性があるため、サンプルDNAの状態（主に二本鎖か一本鎖か）を把握しておく必要があります。2本鎖DNA量は、NanoDrop 3, 300を用いた分光光度法により容易に評価できます。1.5 µLをロードし、測定タイプを核酸に設定して、計算式にDNA 50を選択し、1.5 µLの水で機器を初期化します。ペデスタルを清掃し、1.5 µLの液体でブランク測定を行います。サンプルを溶解させ、ペデスタルを清掃してからサンプルの1.5 µLをロードし、測定ボタンを押します。濃度が提示され、それを利用できます。必要なマイクロリットル数を算出してください。ここではA260/A280比が1.8であることが理想的です。1 µgのサンプルを調製します。しかしながら、わずか200 nanogramsのサンプルであっても、良好な結果を得るには十分です。まず、DNAサンプルを清潔なシリコン処理済みチューブに入れます。その後、最終容量が50 microlitersになるまで滅菌水を加えます。DNAの非特異的な吸着およびタンパク質のチューブ壁への付着を防ぐため、DNAのソニケーションおよび免疫共沈降はシリコン処理済みチューブを用いて行う必要があります。DNAの調製後、サンプルをソニケーションします。免疫共沈降はDNA断片が短い方が効率的なため、ソニケーションによるDNAの断片化が必要です。サンプルをソニケーターにセットし、出力設定を「high」に、時間を「30 seconds」に設定します。30秒間のオンとオフを繰り返す設定にし、ベース部分の充填線まで4°Cの水を満たしてください。サンプルを7分間ソニケーションします。ソニケーションが完了したら、チューブを取り出して氷上に置きます。想定されるサンプルのDNAサイズに合わせて、あらかじめソニケーション条件を最適化しておくことが重要です。例えば、部分的に分解されたDNAサンプルの場合、超音波処理時間を短くする必要があります。超音波処理の結果は、標準的な電気泳動法で可視化できます。この段階では、後の工程で使用するために、300から1000 base pairsの長さのDNA断片を得ることが望ましいです。マイクロアレイおよびPCRアッセイでは、DNAの5分の1を入力用またはリファレンスDNAとして確保しておく必要があります。この場合、超音波処理したDNA 800 nanogramsを免疫沈降に使用し、残りをリファレンスDNAとして取り分けておきます。メディアプロトコルの次のステップは免疫沈降（IP）反応です。一次抗体を添加する前に、DNAを変性させる必要があります。一次抗体は一本鎖DNAに対して感度が高いため、変性が必須となります。サンプルを95 °Cのウォーターバスに10分間置きます。変性ステップが完了したら、直ちにチューブを氷上に移し、少なくとも5分間保持します。これにより、変性したDNAの再アニールを防ぎ、サンプルの冷却後に抗体が最適に結合するようにします。チューブを短時間遠心し、内容物を底に集めます。次に、一次抗体を添加します。使用する抗体量は、バッチごとおよびメーカーごとにタイトレーション（力価決定）して調整してください。本ケースでは、5 µgの一次抗体を加え、次に免疫沈降バッファー（IPバッファー）を加えて最終的に500 µLにします。次に、IP DNAをローテーターに設置し、4 °Cで2時間インキュベートします。インキュベート中のチューブ内での抗体の凝集を防ぐため、回転させる必要があります。一次抗体のインキュベーションが完了する約15分前に、磁性ダイナビーズの洗浄と調製を行います。まず、バイアル内のビーズをボルテックスミキサーで十分に再懸濁させます。次に、30 µLのビーズを清潔なシリコン処理チューブに移し、そのチューブを多検体用マグネットラックに設置します。反応1回につき30 µLのビーズを分注します。ピペッティング誤差や不注意によるビーズの損失に備え、1回分多く用意してください。例えば、8回の反応を行う場合は、9回分に相当する270 µLのビーズを取り出します。磁気ビーズは磁気ラックの壁側に引き寄せられます。ビーズが移動し、チューブの壁面に明確な筋となって定着するまで2分間待ちます。次に、ピペットのチップで壁面のビーズを乱さないよう注意しながら、上清を慎重に吸引して廃棄します。上清を過剰量のIPバッファーに置き換え、ボルテックスした後、再びマグネットラックに2分間置きます。この洗浄操作をもう一度繰り返し、洗浄後のビーズを元の量のみのIPバッファーで再懸濁します。インキュベーションが完了したら、ローテーターからサンプルチューブを取り出します。免疫沈降を完了させるには、30 µLの洗浄済みビーズを反応液に加え、チューブを再びローテーターに戻し、4 °Cで2時間静置します。このインキュベーション中に、抗マウスIgGである二次抗体が一次マウス抗体に結合します。抗マウス抗体はマグネティックDynabeadsにコンジュゲートされており、これにより結合した生成物の回収と、それに続く精製ステップを容易に行うことができます。両方の抗体によるインキュベーションが完了したら、IPチューブをマグネットラックに2分間置きます。この時点で、メチル化DNAは一次抗体によって結合し、一次抗体はさらにdyna bead結合二次抗体によって結合されています。上清を除去して廃棄し、500 µLのIPバッファーで置換します。チューブの内容物を混合し、ラックに戻して2分間静置します。この洗浄工程をIPバッファーを用いてもう一度繰り返します。最後の洗浄後に上清を除去し、ビーズを最後に再懸濁します。400 µLの消化緩衝液に、100 µgのproteinase Kを加えて反応させ、50 °Cで一晩インキュベートします。proteinase K処理は、抗体タンパク質およびDNAに関連する残存タンパク質を消化し、メチル化DNAを溶液中に放出させるために必要です。DNA精製は、手順の2日目に行います。インキュベーターから消化チューブを取り出します。ドラフトチャンバー内で、pH 7のフェノール・クロロホルム等量混合液 500 µLをチューブに加え、十分にボルテックスします。13,000 ×gで10分間遠心分離します。界面を乱したり有機層を除去したりしないように注意して、チューブから上層の水相を慎重に取り出します。水相を新しいチューブに移します。界面が濁っている場合は、2回目の抽出を行うことがあります。次に、3 M 酢酸ナトリウムを10分の1量、この場合は 40 µL 加えます。ペレットの回収を容易にするためのキャリアとして、1 µL のグリコーゲンを使用しても構いません。チューブをボルテックスして内容物を混合します。次に、2倍量の100% ethanolを加え、ボルテックスした後、-20 °Cのフリーザーで20分間凍結させます。凍結後、沈殿したDNAを遠心分離機を用い、13,000 G、4 °Cで20分間遠心分離して回収します。チューブの底にDNAペレットが形成されます。遠心分離機からチューブを取り出し、エタノールを除去します。この際、チューブ底部のペレットを乱さないように注意してください。残留エタノールを除去するために、パルススピンが必要な場合があります。ペレットを洗浄するには、冷えた70%エタノールを500 µL加え、ボルテックスした後、13,000 G、4 °Cでさらに20分間遠心分離します。2回目の遠心分離が完了したら、70%エタノールをパルススピンし、残留エタノールをピペットで除去します。ペレットを乾燥させ、残りのエタノールを蒸発させるため、チューブをキャップ開けた状態でラックに置いておきます。最後に、メチル化濃縮DNAのみを含むペレットを10 µLの滅菌水で再懸濁し、使用前にDNAペレットが十分に溶解するまで時間を置きます。PCRを用いて回収効率を検証することが推奨されます。これは、正常ヒトDNAを増幅するためのプライマーを用い、メチル化されたDNA断片と非メチル化されたDNA断片をそれぞれ異なる産物として増幅するように設計したPCR反応を行うことで実施できます。H 19インプリンティング制御領域は、メチル化されていないゲノム領域を増幅するように設計されたプライマーと併せて使用することが可能です。プライマー配列およびPCRサイクリング条件の例は、付属のプロトコルに記載されています。この時点で、ミートアッププロトコルの最初に取り分けておいたインプットDNAまたはリファレンスDNAを回収する必要があります。PCR反応の一組はインプットDNAを用いてセットアップし、もう一組はメチル化が濃縮されたIP DNAを用いてセットアップします。ミートアップが成功していれば、IP PCRではメチル化プライマーを用いた場合に産物が生成され、コントロールプライマーを用いた場合には産物が生成されません。逆に、入力PCRではメチル化および非メチル化の両方のDNA断片が含まれているため、両方のプライマーを用いて産物が生成されるはずです。メチル化断片が濃縮されたDNAは、PCRシーケンシングやマイクロアレイ解析などの多くのダウンストリームアプリケーションに使用できます。他の分子生物学的手法と組み合わせることで、メチル化プロファイリングやエピゲノミクスの研究を目的として、特定の遺伝子座またはゲノム全域におけるDNAのメチル化状態を解析することが可能です。

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メチル化DNA免疫沈降

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