メチル化DNA免疫沈降

このビデオでは、メチル化DNA免疫沈降またはミートアップのプロトコールを実演しています。メチル化DNAを偏りなく特異的に単離するために使用される方法。哺乳類のDNAメチル化は、シトシンのCファイブ位にメチル基が付加されることを特徴としています。

A CPGジヌクレオチド中に存在すると、可逆的なエピジェネティックなマークであり、正常な発生やいくつかの疾患プロセスにおいて重要な役割を果たします。DNAメチル化の正常な機能には、女性におけるX染色体の不活性化、反復的な要素サイレンシング、ゲノムインプリンティング、およびゲノム安定性の維持が含まれます。DNAメチル化は、癌、デアウィリー症候群、エンゲルマン症候群、免疫不全、中心性不安定性、顔面異常症候群など、多くの疾患でも役割を果たすことが示されています。

例えば、がんでは、過剰なメチル化やプロモーターの異常により、重要な腫瘍抑制遺伝子がサイレンシングされる可能性があります。不適切な低メチル化は染色体の不安定性をもたらし、がん遺伝子の活性化ミートアップは、最初にDNAを300〜1000塩基対のサイズの断片にソニックスケートすることによって達成されます。次いで、超音波処理されたDNAを摂氏95度で変性させる。

5つのプライムメタジンを認識する一次抗体を添加し、メチル化DNA断片に結合させます。磁気ダイナビーズに結合した二次抗体は、一次抗体に結合したDNAの断片を単離するために使用されます。非メチル化フラグメントが除去され、抗体がプロテイナーゼによって消化されます。

KAフェニルクロロホルムクリーンアップは、消化されたタンパク質を除去し、沈殿によりDNAが精製され、メチル化フラグメントが濃縮されます。Meetupでは、DNAをPCRマイクロアレイやシーケンシングなどのアプリケーションに使用できます。ミートアップは通常、2日間の手続きとして行われます。

1日目は、DNA調製、超音波処理、免疫沈降、タンパク質消化を行います。2日目は、pHクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行い、メチル化が強化されたDNAを精製および単離します。ミートアップには、シリコン処理された遠心分離管、DNA日光デバイス、一次抗体、抗5プライムメタジンマウス、モノクローナル抗体、二次抗体、ダイナビーズ、羊に結合したダイナビーズ、抗US IgG、磁気チューブラックなど、いくつかの特別な材料が必要です。

ミートアッププロトコルの最初のステップは、DNAの調製です。DNAの性質を事前に評価することが不可欠です。サンプルの正確な定量が最も重要であり、DNA量を決定するさまざまな方法が望ましくないDNA種の存在によって悪影響を受ける可能性があるため、サンプルDNAの状態を知ることは、それが主に二本鎖であるか一本鎖であるかを知る必要があります。

二本鎖DNAの量は、NanoDrop 3、300 nd負荷1.5マイクロリットルを使用してスペクトル測光によって容易に評価でき、測定タイプを核酸に設定し、計算としてDNA 50を選択し、1.5マイクロリットルの水で装置を初期化します。台座を清掃し、1.5マイクロリットルの液体で器具をブランクにします。サンプルは、サンプルの1.5マイクロリットルをロードし、台座をきれいに溶解し、測定をヒットします。

濃度が与えられ、使用できます。私にとって必要なマイクロリットルの数を計算するには、1.8のA2 60対2 80の比率を浸すのが理想的です。1マイクログラムのサンプルを調製します。

ただし、成功した結果を得るには、わずか200ナノグラムのサンプルで十分です。ミートアップの場合は、DNAサンプルをきれいなシリコンチューブにロードします。十分な滅菌水を追加して、最終的な容量を50マイクロリットルにします。

DNA超音波処理および免疫沈降は、DNAおよびタンパク質のチューブ壁への非特異的結合を防ぐために、シリコン処理チューブ内で実施しなければならない。DNAが調製されたら、免疫沈降はDNAの小さな断片でより効率的になり、サンプルを超音波処理にロードし、電力設定が高に設定されていることを確認し、マシンが30秒に設定されていることを確認するために、DNAを断片化するために超音波処理が必要です。30秒オフに、摂氏4度の水でベースを充填ラインに満たします。

サンプルを7分間超音波処理します。超音波処理が終了したら、チューブを取り外して氷の上に置きます。予想されるサンプル、DNAサイズの超音波処理条件を事前に最適化することが重要です。

例えば、部分的に分解されたDNAサンプルは、より短い超音波処理時間を必要とするでしょう。超音波処理製品は、標準的な電気泳動技術によって視覚化することができる。この時点では、長さが300〜1000塩基対のサイズのDNA断片が、後で使用するために望まれます。

マイクロアレイおよびPCRアッセイでは、DNAの5分の1をインプットまたは参照DNAとして確保する必要があります。この場合、800ナノグラムの超音波処理されたDNAが免疫沈降に使用され、残りは参照DNAとして確保されます。培地プロトコールの次のステップは、一次抗体を添加する前の免疫沈降またはIP反応であり、DNAを変性させる必要があります。一次抗体は一本鎖DNAに感受性があるため、変性が必要です。

サンプルを摂氏95度の水浴に10分間置きます。変性ステップが完了したら、すぐにチューブを氷に少なくとも5分間移します。これにより、リーンがひざまずくことによるDNAの変性を防ぎ、サンプルが冷えたときに最適な抗体結合が可能になります。

チューブを短く回転させて、内容物を底に引き寄せます。次に、一次抗体を添加する必要があります。使用する抗体の量は、バッチごと、およびメーカーごとに滴定する必要があります。

この場合、5マイクログラムの一次抗体を添加し、免疫沈降バッファーまたはIPバッファーを最終容量500マイクロリットルまで追加します。次に、IP DNAをローテーターに入れ、摂氏4度で2時間インキュベートします。インキュベーション中にチューブ内での抗体の凝集を防ぐためには、回転が必要です。

一次抗体のインキュベーションが完了する約15分前に、磁性ダイナビーズを洗浄して調製します。まず、ボルテックスによりバイアル内のビーズを完全に再懸濁します。次に、30マイクロリットルのビーズをきれいなシリコン処理されたチューブに移し、そのチューブを磁気ラックに置いて複数の反応を行います。

1回の反応につき30マイクロリットルのビーズを移し替え、さらにピペッティングエラーや一部のビーズの不注意な損失に備えて、1回の反応を追加するのに十分な量を移します。たとえば、8つの反応の場合です。9回の反応または270マイクロリットルに十分なビーズを取り除きます。

磁気ビーズは、磁気ラックの壁に向かって引き寄せられます。ビーズが移動し、チューブの壁に定義された縞模様に落ち着くまで2分間待ちます。次に、上清ピペットを取り外して廃棄し、ピペットの先端で後壁のビーズを乱さないように注意して

上清を過剰な量のIPバッファボルテックスと交換し、磁気ラックに2分間戻します。この洗浄をもう一度繰り返し、洗浄ビーズを元の容量のIPバッファーに再懸濁します。インキュベーションが終了したら、ローテーターからサンプルチューブを取り出します。

免疫沈降を完了するには、30マイクロリットルの清浄なビーズを反応に加え、チューブをローテーターに4°Cで2時間戻します。このインキュベーション中に、抗マウスIgGである二次抗体が一次マウス抗体に結合します。抗マウス抗体は磁気ダイナビーズに結合しているため、結合した製品の回収が容易で、精製ステップをたどることができます。

両方の抗体とのインキュベーションが完了したら、IPチューブを磁気ラックに2分間置きます。この時点で、メチル化DNAは一次抗体に結合し、一次抗体自体がダイナビーズ標識二次抗体に結合します。上清を取り外して廃棄し、500マイクロリットルのIPバッファーと交換します。

チューブの内容物を混合し、ラックに2分間戻します。この洗浄をIPバッファーでもう一度繰り返します。最後の洗浄液から上清を取り除いた後、最後にビーズを懸濁します。

400マイクロリットルの消化バッファーで、100マイクログラムのプロテイナーゼKで反応を処理し、摂氏50度で一晩インキュベートします。プロテイナーゼK処理は、抗体タンパク質とDNAに関連する残留タンパク質を消化し、メチル化DNAを溶液中に放出するために必要です。DNA精製はミートアップ手順の2日目に行われ、インキュベーターから消化チューブを取り出します。

ヒュームフードで、pH 7で500マイクロリットルの1対1のフェノクロロホルムをチューブに加え、チューブを13, 000で10分間回転させます。G.界面を乱したり、有機層を除去したりすることなく、チューブから上部の水相を慎重に取り除きます。水相を新しいチューブに移します。

インターフェイスが曇って見える場合は、2回目の抽出を行うことができます。次に、この場合は3モル酢酸ナトリウムの10番目の容量、40マイクロリットルを追加します。1マイクロリットルのグリコーゲンは、ペレットのクリーンアップを容易にするためのキャリアとして使用できます。

チューブを渦巻きにして内容物を混合します。次に、100%エタノールの2つの容量を追加し、ボルテックスし、マイナス20°Cの冷凍庫で20分間凍結後。沈殿したDNAを遠心分離機で13, 000G、摂氏4度で20分間スピンダウンします。

DNAペレットがチューブの底に形成されます。遠心分離機からチューブを取り出し、エタノールを取り出します。チューブの底にあるペレットを邪魔しないように注意してください。

残留エタノールを除去するためにパルススピンが必要な場合があります。ペレットを洗浄するには、500マイクロリットルの冷たい70%エタノール渦を加え、13, 000 Gおよび摂氏4度で20分間再度回転させます。2回目のスピンが完了したら、70%エタノールパルススピンを取り出し、Aピペットで残留エタノールを取り除きます。

チューブをキャップを開けたままラックに置いて、ペレットを乾燥させ、残りのエタノールを蒸発させます。最後に、Reusは、メチル化が強化されたDNAと10マイクロリットルの滅菌水のみを含むペレットを懸濁し、使用前にDNAペレットが溶解するのに十分な時間を確保します。ミートアップの習熟度をPCRで検証することをお勧めします。

これは、正常なヒトDNAプライマーの増幅に対して、メチル化DNA断片と非メチル化DNA断片を異なる形で示す産物を増幅するように設計されたPCR反応を実行することで行うことができます。H19インプリンティング制御領域は、メチル化されていないゲノムの領域を増幅するように設計されたプライマーと組み合わせて使用することができる。例えば、プライマー配列およびPCRサイクリング条件は、添付のプロトコル中に見出すことができる。

この時点で、ミートアッププロトコルの開始時に取っておいたインプットDNAまたは参照DNAを取得する必要があります。PCR 反応の 1 つのセットはインプット DNA を使用してセットアップされ、もう 1 つのセットはメチル化に濃縮された IP DNA を使用します。ミートアップが成功した場合、IP PCRはメチル化プライマーを使用して生成物を生成し、コントロールプライマーを使用した生成物は生成しません。

逆に、インプットPCRはメチル化と非メチル化の両方を含んでいるため、両方のプライマーを使用して生成物を生成する必要があります。DNAフラグメント。メチル化フラグメントに濃縮されたDNAは、PCRシーケンシングやマイクロアレイ解析など、多くのダウンストリームアプリケーションに使用できます。

他の分子生物学技術と統合すると、遺伝子座特異的またはゲノムワイドな方法でDNAのメチル化状態を調査し、メチル化プロファイリングやエピゲノミクスの研究に使用できます。