CyDye DIGEフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング

私の名前はマリアで、スウェーデンのNOSにあるY Healthcareで働いています。細胞表面タンパク質は、細胞とその環境との間のコミュニケーションに関与することが多いため、細胞環境の変化によって引き起こされる疾患やその他の生物学的変異についてより多くの洞察を得ることを目的とした研究に特に関心が集まっています。このビデオでは、シンプルなサイドアイ回避細胞表面ラベリングプロトコルをお見せします。これにより、物理的に強化することなく、これらの低存在量のタンパク質を視覚的に濃縮し、これらの細胞表面タンパク質の違いを研究することができます。

この技術に興味をお持ちの場合は、2Dハンドブックで詳細をご覧ください。さらに、この特定のトピックに関するアプリケーションノートがあり、上部にある細胞表面ラベリングプロトコルでは、細胞がまだ無傷のままで細胞をラベル付けします。標識プロセス中、色素は細胞表面タンパク質にのみアクセスできます。

ラベリングステップの後、細胞を分析して細胞表面特異的なラベリングを確認します。標識サンプルは、膜タンパク質と細胞質タンパク質に分画されました。分画されていないサンプルを並行して調製しました。

比較のために、この分画分析は必須ではありませんが、ここでは、細胞表面プロトコルが細胞表面プロチップに特異的であることを示すために行われました。また、標識前に細胞が嘘である下に見られる標準的なETH非食事標識プロトコルを実行し、このようにしてすべての細胞タンパク質が標識にアクセス可能になりました。標識ステップの後、サンプルを2D電気泳動にかけます。

接着細胞は、標的とした細胞表面タンパク質の消化を避けるために、非酵素的手順を使用して分離されます。このプロトコルでは、ゴム製の警察官を使用しますが、酵素3細胞解離培地を使用することもオプションカウントであり、細胞懸濁液をチューブあたり5〜1000万個の細胞の準に分割します。次に、細胞をペレット化し、H-P-S-S-P-H 7.4で洗浄して、細胞培養の痕跡を取り除きます。

血清タンパク質や蛍光成分による培地汚染は、標識や検出に支障をきたす可能性があります。懸濁液中で増殖した細胞は、洗浄後の標識ステップの前に直接ペレット化され、洗浄されます。セルパレットは、HPSS pH 8.5および1モル尿を含む200マイクロリットルの氷冷標識緩衝液に再懸濁されます。

細胞表面タンパク質の最適な標識条件を得るには、常にpHを確認してください。標識する前に、1,000万個のCHO細胞に対して600枚のPICモールドサイドアイを使用しました。サイドアイとセル数の最適な比率は、セルの種類によって異なります。

細胞表面の正確なタンパク質濃度はわからないため。タンパク質のサイドアイラベリングの最適条件を決定する方法については、2D電気泳動の原理と方法のハンドブックに記載されています。細胞をサイドアイDフロア、最小限のサイコロで暗所の氷上で20分間インキュベートします。

標識反応後、非反応性色素を20マイクロリットルの10ミリモルリジンを添加することにより急冷する。次に、標識細胞を冷たいHPSS pH 7.4バッファーで2回洗浄し、余分なサイドアイを除去します。したがって、次のステップである細胞溶解では、不要な細胞内標識やタンパク質のための遊離色素は残っていません。

これで、細胞表面のタンパク質が標識され、細胞が洗浄されてライシングの準備が整います。失われた洗浄ステップからのペレットは、7モル尿、2モルチ尿、4%チャップ、30ミリモルの木、5ミリモル酢酸マグネシウムpH 8.5を含む150マイクロリットルの冷溶解緩衝液に再懸濁され、時折ボルテックスに負担をかけながら少なくとも1時間氷上に放置されます。これで、サンプルを 2D 分離する準備が整いました。

電気分解の最初のステップは、水分補給用のIPDストリップを準備することです。使用するストリップのpH間隔に対応するIPGバッファーを添加して地区再水和液を調製し、再水和トレイのレンズに溶液を添加します。IPGストリップの保護フィルムをはがし、乾燥したゲルを下にして、再水和液が入った再水和トレイにストリップを慎重に置きます。

IPGボックスの蓋を閉め、ストリップを一晩で再水和します。最初の次元である等電点電気泳動では、タンパク質はπに従って分離されます。これは、IPG 4 3 を使用して実行されます。

再水和したストリップをマニホールドにセットし、電極を上部に取り付け、各サンプルから50マイクログラムをサンプル塗布キャップを使用して塗布しました。私たちは、事前に分画せずに分画されていないサンプルを直接適用するか、サンプルを膜画分と細胞質画分に分画してから適用しました。

リード線は閉じて、蛍光サンプルを光から保護します。この装置は推奨に従ってプログラムされ、一晩中運転されました。大きな12%ランビーゲルは、大人の12ゲルを使用して費用がかかりました。

チューブ内の重合アクリーゲルを避けるために、コスター置換溶液を添加した。ゲルは、使用前に室温で一晩重合させました。等電点電気泳動後、ストリップをSDS含有バッファー内でDTTを使用して2ステップで平衡化し、システイン残基のジスルフィド結合を減少させた後、アクリルアミドによる修飾を避けるためにアセトアミドでアルキル化します。

IPGストリップをランニングバッファーに浸し、大きな2つのディグゲルの上に慎重に置きます。ストリップと密封されたゲルの間に空気が溜まらないようにするには、ブロモアノールブルーを上に溶かした2%アグロ溶液を追加します。これで、ゲルは 2 次元 SDS ページ分割の準備が整いました 2 次元 SDS ページ。

タンパク質は分子量に従って分離され、これはトーナルシックスシステムで実行されます。電気泳動チャンバーに陽極ランニングバッファーを充填し、ゲルを挿入し、上部コンパートメントに陰極ランニングバッファープログラムを充填します。推奨に従って電源を供給し、約4〜5時間、または染料の前面がゲルの底に達するまで、光から保護された2次元を実行します。

2次元電気泳動後、台風蛍光イメージャーのグリッパーを使用してゲルカセットをセットします。2つのゲルと3つのチャンネルを同時にスキャンできます。この2つのDLの結果は、A two DLで検出される疎水性タンパク質にいくつかの既知の制限がある場合でも、サンプル中の膜タンパク質の高分解能を示しています。結果は、ここに赤色で示されている多くの新しい細胞表面標識スポットを示していますが、これはここに緑色で示されている標準標識プロトコルを使用して検出されません。

この結果は、細胞表面標識プロトコルが細胞表面タンパク質の標識に非常に特異的であることを示しています。細胞表面タンパク質は排他的に標識されているため、より簡単に視覚化でき、豊富な細胞質タンパク質による減衰が回避されます。非分画膜画分または細胞質画分を有するゲルの蛍光像を上に示します。

以下は、同じゲルポストステインにシルバーを塗布した画像です。その結果、細胞質タンパク質の蛍光標識は示されていませんが、銀染色はゲル中にタンパク質が存在することを示しています。また、この結果では、非分画画と膜画分から同様のスポットマップパターンが示され、2D電気泳動の前に分画する必要がないことが示され、このプロトコルはシンプルで便利です。

SI 2、SI 3、およびSCI 5は、同様の標識パターンを示し、すべて細胞表面プロトコルに適合します。食事実験は、血清飢餓のCHO細胞における細胞表面タンパク質の異なる発現を異なる時間で研究するために、3つのサイドアイDIフロア最小dyすべてを使用して行われました。実験の全サンプルからCYの2つの細胞表面サンプルをプールし、内部標準として使用しました。

いくつかの細胞表面タンパク質の異なる変化は、飢餓期間中に追跡することができました。調製ゲル中のタンパク質の同一性を見つけるための標準プロトコルでは検出されなかった18を超える新規膜タンパク質が、細胞表面プロトコルを使用して検出されました。分析データセット上のスポットへのマッチングを容易にするために、細胞表面サンプルをスパイクする必要がありました。

そこで結果が出ます。その結果、多数の細胞表面タンパク質の高分解能が示されました。このプロトコールは細胞表面タンパク質に非常に特異的であり、細胞内タンパク質の標識は見られませんでした。

この方法を使用すると、標準的なプロトコルと比較してより多くの細胞表面タンパク質を検出でき、すでに見てきたように、非常に簡単に実行できるプロトコルです。細胞表面タンパク質を無傷のままで標識し、膜分画なしで2D電気泳動で直接実行するだけです。したがって、これは細胞表面タンパク質とDテクノロジーを持つタンパク質の違いを研究するための非常に優れたプロトコルです。