Name: CyDye DIGEフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 学ぶ細胞表面タンパク質の蛍光ラベリング法。CyDye DIGE技術を用いて低豊度タンパク質を検出し、2次元電気泳動で差異を解析する。細胞膜分画不要の簡便なプロトコルで、細胞間通信と疾患メカニズムの研究に応用可能。

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我々は、彼らのコラボレーションのための臨床病理学、ウィーン、オーストリアの大学の研究所で教授Dontscho Kerjaschki、コリーナマイルホーファーとシグルドリーガーに感謝。

細胞の培養<ol><li>グルタミンとF - 12ハムの培地私は10％ウシ胎児血清、50 U / mlペニシリン、および50μg/ mlの硫酸ストレプトマイシン（Invitrogen）を含むの標準的な細胞培養の手順を使用して、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO - K1）を成長する。 </li><li>無血清培地に培地を交換する。 CyDye DIGEフルーアと異なる時間点Cy3またはCy5最小限の色素（以下、節の細胞表面のラベルを参照）にあった細胞表面タンパク質にラベルを付けます。 </li><li> CyDye DIGEフルーアCy2と、各時点とラベルからの細胞のプールが同数。それぞれの2 - Dゲルのための内部標準としてこれらを使用してください。 </li><li>実験の大半は、CHO - K1細胞で行うことができますが、マウス胚線維芽細胞（3T3 L1）とマウスの腹水リンパ腫リンパ芽球（EL4）も（データは示さず）が使用できます。 </li><li>グルタミンIIを含むDMEM培地での後者の2つの種類の細胞を成長させる、しかし、そうでない場合は、CHO - K1細胞に使用する同一の条件を使用してください。 </li></ol>細胞表面のラベリング<ol><li>慎重に数えて、5〜10 x106細胞のアリコートに分割し、非酵素的に接着細胞を切り離します。懸濁液中で増殖する細胞の場合は、切り離し手順を省略します。 </li><li> 5分間、約800 × gで細胞懸濁液を遠心してください。培地を含む上清を取り除く。 </li><li> 1ミリリットルの氷冷ハンクス平衡塩溶液（HBSS）pH8.5中でresuspendionでペレットを洗浄してください。 4 800 XG℃で2分間で遠心分離。 </li><li>上清を除去し、200μlの氷冷標識バッファー（HBSS pHは8.5、1 Mの尿素）で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>暗所で氷上で20分間、600 pmolのCyDye DIGEフルーア最小限の色素との完全な細胞にラベルを付けます。 </li><li>リジン20μlの10mMのを加えて反応をクエンチ。 10分間インキュベートする。 </li><li> 4 800 × gで遠心分離℃で2分間に続いて500μlのHBSS pHを7.4に再懸濁によって二回表面標識細胞を洗う。 </li></ol>細胞溶解と分画<ol><li> 150μlの冷溶解バッファー（7 M尿素、2 Mチオ尿素、4％CHAPS、30mMのトリス、5mMの酢酸マグネシウムのpH 8.5）で表面標識細胞を溶解する。時々ボルテックスしながら少なくとも1時間氷上にしておきます。 </li><li> 4℃で10 000 × gでライセートを遠心℃で5分間。上清を新しいチューブに移す。このサンプルは、すべての細胞タンパク質を含有する非画したサンプルです。 </li><li>並行して、前の2次元ゲル電気泳動への膜と細胞質分画に（膜分画キットを使用して、Pierce）を分画するし、上記のように、細胞ペレットを洗浄する。膜画分は、内部と細胞表面の膜タンパク質が含まれています。 </li><li>比較のために、標準的なEttan DIGEの手順3を実行し、溶解、ラベル、および、最終的に、細胞を分画する。 Dクワントキット（GEヘルスケア） - 2を用いてサンプル中のタンパク質濃度を決定する。 </li></ol> 2次元電気泳動<ol><li>イモビのDryStripゲル、イモビDryStrip Reswellingトレイ、一晩450μlのDeStreakの補液で24センチメートル（0.5％、IPGバッファー）を用いてpH 3 - 11NL（24センチ）再水和。 </li><li>マニホールドの陽極カップローディングでDryStripゲルをイモビ、指示に従ってEttan IPGphor II IEF Systemを使用して等電点電気泳動（IEF）を実行するCyDye標識サンプル（50μgの総タンパク質量に相当）適用されます。 </li><li> IEF後、大（26 × 20センチ）12.5％ポリアクリルアミドゲル（SDS - PAGE）上の二つの手順と場所でストリップを平衡化します。 0.5％アガロース（ブロモフェノールブルーを含むバッファを実行しているの）とのオーバーレイ。色素フロントがゲルの底に達するまで30分間、5 W /ゲルで、その後15 W /ゲルでEttan DALTtwelve大きな垂直軸システムを用いて2次元電気泳動を実行します。 </li></ol>イメージングとデータ解析<ol><li> 2次元電気泳動を完了した後、台風9410可変モードのイメージャを使用してCy2と、Cy3またはCy5用ゲルをスキャン。 </li><li>膜画分、細胞質分画、およびDeCyder 2次元差分解析ソフトウェア4を使用して非画した試料からスポットマップを比較する。 </li></ol>後染色<ol><li>イメージング後、銀は標準的な手順5にしたがってゲルを染色。 </li></ol>タンパク質の同定<ol><li> 、収穫の成長、などの非画したサンプルのため、上記の分取量（10 x106 CHO細胞から約1 mgの総タンパク質）の細胞を、洗浄し、溶解する。スパイクとしてCy5標識細胞表面標識サンプル（上記参照）を使用し、そしてタンパク質の非標識取量と一緒に適用されます。 </li><li>上記のような2次元電気泳動を行うが、今回は、aplly 600μgのラベルの付いていないセルは、アノードカップのアプリケーションによってスパイクラベル付け50μgの細胞表面と一緒にライセート。正しいスポットピッキングを可能にするために、基準マーカを使用して、となる配置提言3に記載のゲルキャスティングの前にガラス板をトゥイーン。 </li><li>ディープパープルの全タンパク質染色3を使って総タンパク質の染色をCy5で細胞表面のスポットのマップを、得るためにCy5をチャネルでゲルをスキャンします。 </li><li> DeCyder 2次元ソフトウェアを使用して2つのスポットのマップを一緒に一致させるとCy 5標識細胞表面タンパク質に対応する全てのスポットのピックリストを作成します。 Ettanのスポット処理ステーションを使用して細胞表面タンパク質を選んで、ゲルプラグから抽出し、EttanのDigesterを使ってtrypsinate。 MALDI - TOF質量分析法を用いて識別する。 </li></ol> 表1。Ettan DIGEの実験は図1の細胞表面タンパク質標識プロトコールに従ってラベル血清枯渇細胞からサ ​​ンプルを用いて行った。 <table style="width: 517px; height: 139px;" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="text-align:center; font-weight:bold">サンプル</td><td style="text-align:center; font-weight:bold">血清枯渇の時間</td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> CyDyeでLabelled </td><td style="text-align:center; font-weight:bold">ゲル番号</td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 1 </td><td style="text-align:center;"> - </td><td style="text-align:center;"> CY 3、CY 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 2 </td><td style="text-align:center;"> 30分</td><td style="text-align:center;"> CY 5、CY 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 3 </td><td style="text-align:center;"> 2時間</td><td style="text-align:center;"> CY 3、CY 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 4 </td><td style="text-align:center;"> 4時間</td><td style="text-align:center;"> CY 5、CY 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 5 </td><td style="text-align:center;"> 16時間</td><td style="text-align:center;"> CY 5、CY 2 </td><td style="text-align:center;"> 3 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+the+cell+surface+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of the cell surface proteome.</a> Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).</li>
<li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ettan+DIGE+System+User+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+user+manual+18-1164-40%22%5BJournal%5D)">Ettan DIGE System User Manual.</a> GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients%2C+principles+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+handbook+80-6429-60+Edition+AB%22%5BJournal%5D)">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li>
<li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> Proteomics. 2, 579-5785 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li>
</ol>

タンパク質濃度 twoラベリングワークフローの概要を図1に示されています。細胞表面タンパク質標識プロトコールに従ってラベル際に細胞がまだそのままなので、唯一の細胞表面タンパク質は、染料にさらされている。細胞内部だけでなく外部の標識とタンパク質が（図1）ラベルが付いている前に、標準的なEttan DIGEプロトコールでは、細胞を溶解している。細胞表面タンパク質は、特に定量することができないので、細胞表面のタンパク質標識プロトコルのタンパク質への染料の相対的な量は、知られていない。しかし、それは細胞表面のタンパク質が細胞タンパク質2の非常に低い割合を構成することが知られている。染料の600 pmolのに約5〜10 × 10 6細胞を使用した。本研究でnonfractionatedサンプルの唯一の12.5から25パーセントは、2次元電気泳動のために使用されて以来、それは少数の細胞を使うこともできます。 <img src="/files/ftp_upload/old/945_2008_9_11_...

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE Kit, 2 nmol</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9345-30</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>IPGバッファー pH 3-11NL</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6004-40</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-77</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox</td><td>ツール</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-65</td><td></td></tr><tr><td>IPGboxキット</td><td>ツール</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-92</td><td></td></tr><tr><td>DeStreak再水和液</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-19</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip カバー液</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 3 等電点電気泳動装置</td><td>装置</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Ettan IPGphor マニホールド</td><td>装置構成部品</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6498-38</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTtwelveゲルキャスター </td><td>ツール</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6467-22</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTtwelve 分離ユニットおよび電源/制御ユニット</td><td>装置</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6466-46</td><td>230 Vユニット：80-6466-27</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 可変モードイメージャー</td><td>装置</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-81</td><td></td></tr><tr><td>Ettan スポットピッカー</td><td>器具</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1145-28</td><td></td></tr><tr><td>エタン分解装置</td><td>装置</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-68</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Spotter</td><td>装置</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-67</td><td></td></tr><tr><td>Ettan MALDI-TOF</td><td>装置</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-33</td><td></td></tr><tr><td>DeCyder 2-D 差分解析ソフトウェア</td><td>その他</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4012-01</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant解析ソフトウェア</td><td>その他</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9236-62</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1319-01</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne ジチオスレイトール (DTT)</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1318-01</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1313-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Glycerol 87%</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1325-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1310-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne TEMED</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne 過硫酸アンモニウム</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1311-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne グリシン </td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>膜タンパク質の2次元サンプル調製</td><td>試薬</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89864</td><td></td></tr><tr><td>硫酸ストレプトマイシン</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

cydye digeフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

表面タンパク質は、その環境に反応すると、隣接細胞と相互作用する細胞の能力の中心となっています。彼らはほとんどすべての細胞内シグナル伝達の誘導剤であることが知られている。また、彼らは環境適応や薬物治療で重要な役割を果たしており、しばしば疾患の病因と病理学（1）に関与している。タンパク質 - タンパク質相互作用は、シグナル伝達経路に固有であり、これらの複雑な生物学的プロセスのより多くの洞察を得るために、高感度かつ信頼性の高い方法は、細胞表面のタンパク質を研究するために必要とされる。二次元（2 - D）電気泳動は、差動の変化を研究するために複雑なタンパク質サンプルのバイオマーカーや他の標的の検出のために広範に使用されます。彼らの低濃度（細胞タンパク質の1 2％）が部分的に原因の細胞表面タンパク質は、分画もしくは濃縮のいくつかの他のタイプなしで2 - Dゲルで検出するのは困難である。彼らはまた、しばしば不十分な彼らの疎水性の性質と高分子量（2）による2 - Dゲルで表されます。本研究では、我々はタンパク質のこの重要なグループの特定のラベリングと検出のためのCyDye DIGEフルーア最小限の染料を使用して完全な細胞のための新しいプロトコルを提示する。結果は、細胞内タンパク質の最小限のラベルを持つ細胞表面タンパク質の大量の特定のラベルを示した。このプロトコルは、使用するために、迅速に簡単です、そしてすべての3つのCyDye DIGEフルーア最小限の色素（CY 2、サイ3、Cyの5）の細胞表面タンパク質を標識するために使用することができます。これらの機能は、DeCyder 2次元差分解析ソフトウェアを用いてタンパク質発現の変化のEttan DIGE技術と解析との2次元蛍光差ゲル電気泳動（2 - D DIGE）を用いて多重化することができます。細胞表面タンパク質のレベルは、時間の種々の長さのためのCHO細胞（表1参照）の血清飢餓の間に続いた。存在量の小さな変化を高精度に検出され、その結果は定義されている統計的手法によってサポートされています。

シンプルで具体的な方法は、分別工程なしで蛍光標識し、細胞表面タンパク質の拡張検出用に実証された。細胞表面タンパク質の差の存在量は、（2 - D）二次元電気泳動とEttan™DIGE技術を用いて解析した。

CyDye DIGEフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング

表面タンパク質は、細胞が環境に反応し、隣接する細胞と相互作用する能力において中心的な役割を担っています。これらは...の誘導因子であることが知られています。

私はMariaで、スウェーデンのNOSにあるY Healthcareで研究を行っています。細胞表面タンパク質は、細胞と周囲の環境とのコミュニケーションに深く関与していることが多いため、疾患への理解を深めるだけでなく、細胞環境の変化によって引き起こされるその他の生物学的変動を解明することを目的とした研究において、特に重要視されています。このビデオでは、シンプルなサイドアイ・ドッジ細胞表面標識プロトコルをご紹介します。これにより、物理的な濃縮を行うことなく、低発現のタンパク質を視覚的に濃縮し、この技術を用いてそれら細胞表面タンパク質の差異を解析することが可能になります。この技術に興味がある場合は、2Dハンドブックでより詳細な情報を確認できます。さらに、この特定のトピックに関するアプリケーションノートをjobからダウンロードいただけます。上記の細胞表面標識プロトコルでは、細胞をそのままの状態で標識します。標識プロセスにおいて、染料は細胞表面タンパク質にのみアクセスします。ラベル化ステップの後、細胞表面特異的なラベル化を確認するために細胞を解析します。ラベル化サンプルを膜タンパク質と細胞質タンパク質に分画しました。並行して、分画していないサンプルも調製しました。比較のため、この分画解析は必須ではありませんが、ここでは細胞表面プロトコルが細胞表面タンパク質に特異的であることを示すために実施しました。また、以下に示す標準的なETH非食事制限標識プロトコルも実施しました。この方法では、標識前に細胞を溶解させるため、すべての細胞内タンパク質が標識可能となります。標識ステップの後、サンプルは2次元電気泳動に供されます。標的となる細胞表面タンパク質の消化を避けるため、非酵素的な手法を用いて接着細胞を剥離させます。本プロトコルではラバーポリスマンを使用しますが、Enzyme-Free Cell Dissociation Mediumを使用することも可能です。細胞懸濁液をカウントし、1本あたり500万から1000万個の細胞になるように分注します。その後、細胞を遠心してペレット化し、細胞培養液の痕跡を除去するためにH-P-S-S-P-H 7.4で洗浄します。血清タンパク質や蛍光成分による培地の汚染は、標識および検出の妨げとなる可能性があります。浮遊状態で増殖している細胞は、標識ステップの前の洗浄工程で直接ペレット化し、洗浄します。細胞ペレットを、HPSS pH 8.5および1 molar uriaを含む200 microlitersの氷冷標識バッファーで再懸濁します。細胞表面タンパク質の最適な標識条件を得るためには、常にpHを確認してください。標識に際し、1,000万個のCHO細胞に対して600 pic molのside-eyeを使用しました。side-eyeと細胞数の最適比は、細胞型によって異なります。細胞表面の正確なタンパク質濃度は不明であるため、タンパク質のサイドチェーン標識に最適な条件を決定する方法については、「2D electrophoresis principles and methods handbook」に記載されています。細胞をサイドチェーン標識用ダイスと共に、氷上の暗所で20分間インキュベートします。標識反応後、10 millimolarのリシンを20 µL添加して未反応の色素をクエンチします。次に、標識した細胞を冷えたHPSS pH 7.4バッファーで2回洗浄し、過剰な色素を除去します。これにより、次のステップである細胞溶解において、不要な細胞内標識やタンパク質への標識を引き起こす遊離色素が残らないようにします。細胞表面のタンパク質が標識され、細胞の洗浄が完了し、溶解可能な状態になりました。最後の洗浄ステップで得られたペレットを、7 M urea、2 M thiourea、4% CHAPS、30 mM Tris、5 mM 酢酸マグネシウム（pH 8.5）を含む150 µL の冷溶解バッファーに再懸濁し、時折ボルテックスミキシングを行いながら、氷上で少なくとも1時間静置します。これでサンプルは2D分離が可能な状態になります。電気泳動の最初のステップは、再水和用のIPGストリップを準備することです。使用するストリップのpH範囲に応じたIPG緩衝液を加え、再水和溶液を調製し、その溶液を再水和トレイの槽に入れます。IPGストリップの保護フィルムを取り除き、乾燥したゲル面を下にして、再水和溶液の入った再水和トレイに慎重に配置します。IPGボックスの蓋を閉じ、ストリップを一晩再水和させます。第一次元である等電点電気泳動では、タンパク質がそのpIに基づいて分離されます。これはIPG 4/10を用いて行われます。再水和させたストリップをマニホールドに配置し、電極を上部に装着します。サンプル適用キャップを用いて、各サンプルから 50 micrograms を適用しました。分画前の非分画サンプルを直接適用するか、あるいはサンプルを膜画分と細胞質画分に分画してから適用しました。蛍光サンプルを光から保護するため、リードを閉じます。機器を推奨設定に従ってプログラムし、一晩走らせました。大きな12%のlambyゲルを、成体用12ゲルを用いて作製しました。チューブ内でのアクリルアミドゲルの重合を防ぐため、コスター置換溶液を添加しました。ゲルは使用前に室温で一晩重合させました。等電点電気泳動の後、ストリップを取り出し、2段階のステップでSDS含有バッファーを用いて平衡化させました。まずDTTを用いてシステイン残基のジスルフィド結合を還元し、次にアクリルアミドによる修飾を防ぐため、ヨードアセトアミドを用いてアルキル化を行いました。IPGストリップをランニングバッファーに浸し、2次元ゲルの上部に慎重に配置します。ストリップとゲルの間に気泡が入らないよう、ブロモフェノールブルーを含む融解した2%アガロース溶液を上から加えます。これで、2次元目のSDS-PAGE分離の準備が整いました。タンパク質は分子量に基づいて分離され、これはtonal sixシステムを用いて行われます。電気泳動槽にアノード走行バッファーを満たし、ゲルを挿入して、上部コンパートメントにカソード走行バッファーを満たします。推奨に従って電源を設定し、遮光状態で2次元電気泳動を約4〜5時間、または色素前線がゲルの下端に到達するまで実施します。2次元電気泳動後、グリッパーを用いてゲルカセットをTyphoon蛍光イメージャーに設置します。2枚のゲルと3つのチャンネルを同時にスキャンすることが可能です。この2次元電気泳動（2-DL）の結果は、疎水性タンパク質が2-DLで検出されにくいという既知の制限があるものの、サンプル中の膜タンパク質の高い分解能を示しています。結果からは、標準的なラベル化プロトコル（緑色で表示）では検出されなかった、多くの新しい細胞表面ラベルスポット（赤色で表示）が確認できます。この結果は、細胞表面標識プロトコルが細胞表面タンパク質の標識に対して非常に特異的であることを示しています。細胞表面タンパク質のみが標識されるため、可視化が容易になり、豊富に存在する細胞質タンパク質による減衰を避けることができます。上図には、分画されていない膜画分または細胞質画分を含むゲルの蛍光画像が示されています。以下は、同じゲルを銀染色した後の画像です。結果から、細胞質タンパク質の蛍光標識は認められませんが、銀染色によりゲル中にタンパク質が存在することが示されています。また、非分画画分と膜画分で同様のスポットマップパターンが得られたことから、2D電気泳動の前に分画を行う必要がないことが示されており、本プロトコルを簡便かつ効率的なものにしています。SI two、SI three、およびSCI fiveは同様の標識パターンを示し、いずれも細胞表面プロトコルに適合しています。血清飢餓状態の異なる時間のCHO細胞における細胞表面タンパク質の差分発現を研究するため、3種類のside eye DI floor minimal dyすべてを用いて食事実験が行われました。実験内のすべてのサンプルから得られたCY two細胞表面サンプルをプールし、内部標準として使用しました。飢餓期間中におけるいくつかの細胞表面タンパク質の変動を追跡することができました。細胞表面プロトコルを用いることで、調製用ゲルのタンパク質同定における標準プロトコルでは検出されなかった18種類以上の新規膜タンパク質が検出されました。分析データセット上のスポットへの照合を容易にするため、細胞表面サンプルをスパイクすることが必要でした。結果は以下の通りです。結果から、多数の細胞表面タンパク質が高解像度で検出されていることがわかります。このプロトコルは細胞表面タンパク質に対して非常に特異性が高く、細胞内タンパク質の標識は認められませんでした。この手法を用いることで、標準的なプロトコルと比較してより多くの細胞表面タンパク質を検出することができ、またすでにご覧いただいた通り、非常に簡便に実施できるプロトコルです。細胞表面タンパク質がそのままの状態でラベル化し、膜分画を行うことなく直接2次元電気泳動に供します。したがって、本プロトコルは細胞表面タンパク質の研究および、D技術を用いたそれらの差異を検討する上で非常に有効です。

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我々は、細胞外のエピトープに特異的なポリクローナル抗体を用いてニューロンを生体の表面上のタンパク質を標識するための方法を記載している。タンパク質、細胞表面上の抗体によって結合され、その後、エンドサイトーシスを介して内在化は、上の残りのタンパク質から区別、又はインキュベーション中に表面に輸送することができる。...

ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

ここでは、光親和性標識を使用して低分子結合タンパク質を同定する方法を説明します。この技術の利点は、標的タンパク質の結合および共有結合標識が生細胞環境内で行われるため、細胞溶解時に天然タンパク質の構造および結合条件を破壊するリスクが排除されることです。...

ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

リンパ球は、適応免疫応答の主要なプレーヤーです。ここでは、in vitroおよびin...

単離とマウスリンパ球の活性化

生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる...

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

このプロトコルは、市販のDNAゲル染色を有するミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、超分解能構造照明顕微鏡(SR-SIM)による生細胞のタイムラプスシリーズの取得、およびヌクロイド運動の自動追跡を記述する。...

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

重要な蛍光色素は、現代の真菌細胞生物学における生細胞イメージング解析に不可欠なツールです。本論文では、糸状菌における血漿膜動態、エンド/エキソサイトーシスおよび細胞壁形態形成を追跡するための確立された、あまり知られていない蛍光色素の適用について詳しく述べる。...

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体ダイナミクスを研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行う実験プロトコルとデータ分析ワークフローを提示する。...

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

学ぶ細胞表面タンパク質の蛍光ラベリング法。CyDye DIGE技術を用いて低豊度タンパク質を検出し、2次元電気泳動で差異を解析する。細胞膜分画不要の簡便なプロトコルで、細胞間通信と疾患メカニズムの研究に応用可能。

CyDye DIGEフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング

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