컬럼 크로마토그래피

컬럼 크로마토그래

유기 화학 실험실에서 화합물을 정제하고 분리하기 위한 여러 기술이 존재합니다. 10g 미만의 화합물을 분석에 사용할 수 있는 마이크로 스케일 분리를 위한 가장 신뢰할 수 있는 분리 기술 중 하나는 컬럼 크로마토그래피입니다. 이 기술은 용해도, 극성, 소수성, 크기 및 전하와 같은 물리적 특성을 기반으로 혼합물의 화합물을 분리합니다.

크로마토그래피의 기초

모든 크로마토그래피 시스템의 주요 구성 요소는 고정상, 이동상 및 분석할 시료 혼합물입니다. 컬럼 크로마토그래피에서 고정상은 일반적으로 마이크로 스케일 비드이며, 수직 컬럼에 균일하게 충전되어 있습니다. 용매라고도 하는 이동상의 연속적인 흐름이 컬럼 상단에 추가되며, 이는 중력을 통해 또는 펌프에 의해 제어된 유속으로 고정상을 통해 흐릅니다.

샘플은 소량의 용매에 용해된 다음 컬럼 상단에 추가됩니다. 샘플이 고정상을 통해 흐르도록 하기 위해 더 많은 용매가 추가됩니다. 혼합물의 화합물은 서로 다른 특성에 따라 이동상과 고정상을 분할하고 개별 띠를 형성합니다.

고정상과 강한 상호 작용을 하는 화합물은 고정상과의 약한 상호 작용을 가진 화합물보다 느리게 움직입니다. 따라서 약한 상호 작용이 있는 화합물은 강한 상호 작용이 있는 화합물보다 더 일찍 컬럼을 빠져나가거나 용리됩니다. 화합물과 고정상의 상호 작용 강도는 지연 계수(R_{, f})에 의해 정의되며, 이는 이동상이 이동한 거리에 대한 구성 요소가 이동한 거리의 비율입니다. 지연 계수는 먼저 박막 크로마토그래피를 수행하여 결정됩니다.

지연 계수 값이 높으면 샘플이 고정상과 강하게 상호 작용하고 용리하는 데 시간이 오래 걸린다는 것을 나타냅니다. 지연 계수 값이 낮으면 샘플이 고정상과 매우 강하게 상호 작용하지 않고 더 빨리 용리된다는 것을 나타냅니다. 화합물은 개별 띠로 분할하고_R-f 값이 다르기 때문에 서로 다른 시간에 컬럼에서 용리되기 때문에 컬럼 아래에서 분획 단위로 용매를 수집하여 개별적으로 분리할 수 있습니다.

컬럼 크로마토그래피 고려 사항

크로마토그래피 컬럼은 수직 방향의 유리 또는 플라스틱 튜브입니다. 컬럼의 크기는 몇 센티미터(예: 파스퇴르 피펫)에서 미터(예: 산업용 칼럼)까지 다양합니다. 컬럼의 직경은 분리할 샘플의 양에 따라 달라지는 반면, 컬럼의 길이는 분리 난이도에 따라 달라집니다. 개별 밴드로 가장 효율적으로 분할하려면 얇은 샘플 레이어가 필요합니다. 따라서 적절한 직경을 결정하는 것은 중요한 단계입니다. 컬럼의 직경에 비해 너무 많은 시료를 주입하면 직경이 더 큰 컬럼에서 동일한 부피의 시료보다 더 넓고 덜 정의된 밴드가 생성됩니다.

열의 길이를 선택할 때 구성 요소의 R_f 값을 고려해야 합니다. 유사한 지연 계수를 가진 구성 요소는 분리하기 어려울 수 있으며 개별 밴드를 해결하기 위해 더 긴 컬럼이 필요할 수 있습니다. 지연 계수가 매우 다른 화합물은 쉽게 분할되어야 하므로 긴 컬럼이 필요하지 않을 수 있습니다. 고정상을 선택할 때는 각 구성요소에 대해 서로 다른 지연 계수를 생성하는 위상을 선택하는 것이 중요합니다.

컬럼 준비는 크로마토그래피 컬럼 실행에서 가장 중요한 부분입니다. 컬럼에 충전된 고정상의 질량은 샘플의 질량의 20배 이상이어야 합니다. 기둥 바닥에 다공성 디스크가 없으면 면과 얇은 모래 층으로 포장해야 합니다. 이렇게 하면 컬럼의 출구를 통해 고정상이 손실되는 것을 방지할 수 있습니다.

컬럼을 패킹하는 방법에는 건식 패킹 방법과 슬러리 방법의 두 가지가 있습니다. 건식 방법에서는 고정상이 분말 형태로 컬럼으로 전달됩니다. 그런 다음 용매가 실리카겔 컬럼의 모든 부분에 침투하도록 이동상/용매로 컬럼을 여러 번 세척합니다. 이 방법을 올바르게 수행하지 않으면 컬럼에 건조한 패치, 채널 및 기포가 형성될 확률이 높아질 수 있습니다. 이러한 결함은 혼합물의 성분을 분할하는 컬럼의 기능에 영향을 미칩니다.

슬러리 방법은 기포, 건조 영역 및 채널을 포함하지 않는 보다 균일한 충전 컬럼을 제공합니다. 이 방법의 경우, 고정상을 용매와 혼합하여 일관된 슬러리를 형성합니다. 그런 다음 슬러리는 측면을 두드리면서 형성된 기포를 제거하면서 컬럼으로 옮겨집니다. 컬럼의 마개가 있는 경우 이 단계에서 용매가 배출될 수 있도록 열어야 합니다.

실리카겔 크로마토그래

크기, 전하 및 소수성과 같은 화합물의 혼합물을 분리하기 위해 다양한 특성이 활용됩니다. 유기 화학에서 화합물을 분리하는 데 사용되는 한 가지 특성은 극성입니다. 이를 위해 실리카겔과 알루미나 겔이 가장 일반적으로 사용되는 고정상입니다. 실리카겔은 극성이 매우 높으며 극성 화합물과 강력한 쌍극자-쌍극자 상호 작용을 형성합니다. 또한 실리카겔은 표면에 -OH 기가 존재하기 때문에 분석물과 수소 결합을 형성할 수 있습니다.

가장 극성이 높은 혼합물의 성분은 실리카겔에 강하게 결합하여 컬럼을 통해 천천히 이동하는 반면, 비극성 성분은 이동상에서 더 잘 용해되고 컬럼을 통해 빠르게 이동합니다. 따라서 혼합물의 성분이 서로 다른 극성을 갖는 것이 중요합니다. 고정상과 강하게 상호 작용하는 성분은 컬럼을 통해 극성 이동상을 유동시켜 용리됩니다.

참조

1. Shuler, ML, Kargi, K., DeLisa, M. (2017). 바이오 프로세스 공학, 기본 개념. 어퍼 새들 리버, 뉴저지 : 프렌티스 홀.
2. Harris, D.C. (2015). 정량적 화학 분석. 뉴욕, 뉴욕 : WH 프리먼 앤 컴퍼니.

컬럼 크로마토그래피는 패킹된 컬럼을 사용하여 일반적으로 미세한 비드 형태의 고정상과의 상호 작용을 기반으로 화합물을 분리하는 기술입니다. 구슬 사이의 공간은 용제로 채워져 있습니다. 컬럼을 열면 용매가 고정상을 통해 흐를 수 있습니다. 충진된 컬럼의 상단에 혼합물을 적용한 다음 더 많은 용매를 주입하면 혼합물이 이동상으로 이동하여 고정상을 통해 흐릅니다.

혼합물의 각 성분은 다른 방식으로 고정상과 상호 작용합니다. 일부 구성 요소는 고정상과의 상호 작용이 약하여 컬럼을 통해 빠르게 이동하는 반면, 다른 구성 요소는 고정상과 강한 상호 작용을 가지므로 더 느리게 이동합니다. 이것은 서로 다른 화합물을 띠로 분리하여 작은 조각으로 수집합니다. 이를 통해 각 화합물을 정제할 수 있습니다.

그렇다면 혼합물을 분리하는 데 어떤 종류의 속성을 사용할 수 있습니까? 가장 일반적으로 사용되는 속성 중 하나는 극성입니다. 이를 위해 이산화규소의 한 형태인 실리카겔이 고정상으로 자주 사용됩니다. 실리카겔은 쌍극자-쌍극자 상호 작용 및 표면에 형성되는 -OH 그룹을 통한 수소 결합에 의해 화합물과 상호 작용합니다. 따라서 극성 화합물은 고정상과 강하게 상호 작용하는 반면 비극성 화합물은 약하게 상호 작용합니다.

분리를 위해 악용될 수 있는 다른 특성으로는 크기, 전하 및 소수성이 있습니다. 고정상을 컬럼에 로드하는 일반적인 방법은 고정상과 용매의 슬러리로 사용하는 것입니다. 그런 다음, 고정상은 슬러리를 압축하기 위해 컬럼을 통해 더 많은 용매를 유동시켜 패킹됩니다. 고정상은 기포, 빈 채널 또는 건조한 패치 없이 균일하게 충전되는 것이 중요합니다. 이는 흐름을 방해하고 밴드의 혼합을 유발할 수 있습니다.

컬럼을 선택할 때 직경은 분리할 샘플의 부피를 기준으로 합니다. 샘플은 컬럼 상단을 얇고 균일한 층으로 덮어야 합니다. 샘플 레이어가 두꺼울수록 밴드가 넓어집니다. 컬럼 길이는 화합물이 고정상에서 얼마나 잘 분리되는지에 따라 달라집니다. 고정상에 대해 유사한 친화도를 가진 화합물은 적절한 분리를 위해 긴 컬럼이 필요합니다. 그러나 고정상에 대한 친화도가 매우 다른 화합물의 혼합물은 더 짧은 컬럼에서 분리될 수 있습니다.

이 실험실에서는 먼저 실리카겔 컬럼을 패킹하고 준비하여 컬럼 크로마토그래피를 살펴봅니다. 그런 다음 컬럼을 사용하여 녹색 식품 염료의 착색 성분을 분리합니다.