Method Article

Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

DOI:

10.3791/1009

⸱

February 11th, 2009

 ,  , 
1Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 보고서는 physiologic 전단 응력 하에서 백혈구 내피 상호 작용을 공부를위한 병렬 플레이트 흐름 챔버 분석의 시각적 묘사를 제공합니다. 이 방법은 트리거 백혈구가 내피 세포 표면에 롤링되는 내피 (E) - selectin과 E - selectin 백혈구 리간드의 역할을 조사에 특히 유용합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E - selectin은 피부, 뼈 및 염증 조직에 leukocytes 순환 모집을 시작하는 데 도움이 microvascular 내피 세포에 종류 - 1 막 단백질이다. E - selectin의 표현이 피부와 뼈가 microvessels에 제정되고 같은 염증 조직에서 IL - 1α 및 / TNF - α, microvessels 등 프로 염증 크린 시토킨에 의해 inducible 있습니다. 이 렉틴과 수용체는 mediates 특성 회전 동작의 결과를 순환 leukocytes에 탄수화물 카운터 - 수용체의 리간드와 상호 작용을 약한 구속력. 이러한 상호 작용은보다 안정 접착제 이벤트 및 diapedesis 활동, 백혈구 압연 활동의 특성화 및 백혈구 E - selectin의 리간드의 신분을 앞에 있기 때문에 백혈구 인신 매매 및 염증의 연구 및 안티 - 염증성 치료제의 개발 (1-5)의 주요 목표를했습니다 . 이 보고서의 목적은 physiologic 혈액 흐름 조건 E - selectin E - selectin의 리간드 상호 작용을 연구에 가장 널리 사용되는 기술의 시각, 포괄적인 설명을 제공하는 것입니다. 하버드 피부 질환 연구 센터와 함께 우리 연구실은 디지털 시각화하고 새 레코딩 소프트웨어, NIS - 요소와 함께 최첨단가 병렬 플레이트 흐름 챔버 장치를 사용합니다. 이 기술은 우리가 화면의 시각화뿐만 아니라 비디오 형식으로 기록 롤링 활동을 실시간으로 접착 이벤트를 분석할 수 있습니다. 같은 주파수, 전단 저항을 압연 및 바인딩 / 효율성을 tethering 같은 세포 접착 매개 변수, Excel 스프레드 시트에 수출 및 통계 분석의 대상, NIS - 요소 소프트웨어로 계산됩니다. 데모 여기에 제시, 우리는 살고 인간 골수 내피 세포 (hBMEC)에서 E - selectin에 의존 백혈구 압연 활동을 조사하기 위해 병렬 플레이트 흐름 챔버를 채용. 불후의 hBMEC 세포 라인, HBMEC - 60 세포, 우리의 내피 세포 모델 (6)로 사용하는 동안 E - selectin 리간드의 높은 수준을 표현하는 인간의 조혈 전구 KG1a 세포는, 우리 백혈구 모델로 사용되었습니다. 유도 및 시뮬레이션 네이티브 E - selectin 표현 흐름 챔버에서 HBMEC - 60 세포를 처음 IL - 1이 활성화되었습니다.하려면 우리의 비디오 프레 젠 테이션은 병렬 플레이트 흐름 분석 프로 테아제 또는 glycosidase을 구현하여 ascertained 수있는 흐름 챔버에 physiologic E - selectin - 중재 백혈구 압연 활동 및 백혈구 E - selectin 리간드 (S)의 기능 특성을 공부에 적합한 방법입니다했다 digestions.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 흐름 챔버에 대한 배양 접시에 hBMEC의 준비 (HBMEC - 60 세포) Monolayer

  1. 코트 35 37 4 박 20μg/ml의 fibronectin의 2ml (PBS)을 ° C로 3 시간 동안 X 10mm 조직 문화 요리 ° C.
  2. 요리 fibronectin 솔루션을 기음과 1.5 X10 5 HBMEC - 60 세포를 추가 HEPES 및 글루타민과 함께 [매체 199 10% FBS 10 % 인간 세럼, 5 단위 / ML의 헤파린, 1ng/ml 재조합 인간 fibroblast의 성장 인자, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신] 요리와 그들이> 90 % 합류로 성장할 수 있도록. (이 2 일이 소요)
  3. 성장 미디어를 기음과, E - selectin 표현을 상향 조절, 4-6 시간에 대한 IL - 1β 50ng/mL 신선한 매체를 추가하십시오. 세포 monolayers 이제 분석을 압연에 대한 준비가되어 있습니다. 안티 - 인간의 E - selectin 모아브 (클론 BBIG - E4 (5D11)가) 37시 ~ 1 시간에 대한 20μg/ml에 추가할 수 있습니다 ° C.를 끄고, E - selectin 기능을 차단하려면

2. 흐름 챔버에 대한 인간의 조혈 전구 KG1a 전지의 준비

  1. 인간 조혈 전구 KG1a 세포는 글루타민과 함께 RPMI - 1640에 (1x10 6 셀 / ML) confluency로 성장와 10 % FBS / 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신과 흐름 챔버 분석에 사용하기 위해 술병에서 직접 pipetted입니다.
  2. 휴대폰 번호는 hemacytometer 후 세포가 10mM HEPES (H / H 버퍼)와 2mM CaCl 2 HBSS 1 X 10 6 세포 / ML에서 다시 보류 아르를 사용하여 계산됩니다
  3. 세포 분석에 사용할 때까지 얼음에 저장됩니다.

3. 현미경, 병렬 플레이트 흐름 회의소와 주사기 펌프 (그림 1)의 준비

figure-protocol-1

그림 1. 병렬 플레이트 흐름 회의소 분석의 일러스트. 거꾸로 현미경, 하버드 주사기 펌프, 컴퓨터 / 카메라 및 병렬 플레이트 흐름 챔버는 효율적이고 재현성 세포 분석을위한 최적의 배열에 배치됩니다.

  1. 주사기 펌프로 거꾸로 현미경과 전원 전원 및 광원의 전원을 켜고 현미경에 10X 목표를 선택합니다.
  2. 홀더에 50mL 원뿔 튜브를 삽입하고 H / H 및 2mM CaCl 2 입력합니다.
  3. 50mL 원뿔 튜브 아래의 테스트 튜브 홀더에 넣어 5ml 플라스틱 테스트 튜브
  4. (주사기의 플런저과 몸 모두가 모두 확보되어 있는지 예정) 주사기 펌프에 60mL 주사기를 배치합니다.
  5. 60mL 주사기 끝 3 방향 정류장 - 콕에 5mL 주사기를 연결 중지 - 수탉 3 방법을 첨부합니다.
  6. 오른쪽에있는 입력 튜브, 뒤로 왼쪽과 진공관 출력 튜브와 함께 현미경 무대 플레이스 병렬 흐름 회의소 장치 (GlycoTech 주식 회사).
  7. 병렬 플레이트 장치가 무대에 맞게 수 있도록 진공 야외 밸브에 진공 튜브를 연결합니다. (이 테스트 흐름 챔버에서 진공 스커트가 빵빵한 경우.) 공기 밸브를 끄십시오.
  8. 출력 튜브 라인 (현미경의 가장 왼쪽에) 3 방향 중지 - 물건에 연결합니다. 장치는 현재 HBMEC - 60 monolayer 플레이트에 삽입하기위한 준비가되어 있습니다.
  9. 현미경의 중심에 자리 HBMEC - 60 monolayer 판과 장소.
  10. 진공 및 위치 monolayer 판은 중앙에있다 것과 같은 접시 위의 흐름 챔버 장치를 켭니다.
  11. 부드럽게 HBMEC - 60 monolayer 판에 흐름 챔버 장치를 낮추고 흐름 챔버 장치가 다운 흡입 수 있습니다. (가 이스케이프 공기도 소리이어야하며이 시점에서 당신은 고무 가스켓을 압축 챔버에 압력을 적용해야 할 수도 있습니다.)
  12. 일단 진공 곳에 입력 튜브 2mM CaCl 2와 H / H를 포함하는 50mL 원뿔 튜브로 (오른쪽)에 설립되었습니다.
  13. 오픈 3 방향 정류장 - 콕에서 60mL 주사기와 장소 펌프로 흐름을 허용하는 '펌프 모드. "
  14. 접시에있는 세포를 운반하지 않고 입력 / 출력 라인에서 공기를 제거하려면 액체가 장비에 도달 ML / 분 직전에 다음 신속하게 0.5으로 설정, 흡기 관을 채우기 위해 2mL/minute에서 설정 주사기 펌프를 사용합니다. 이 신중하게 설정하고 접시에서 monolayer 사하여 주실 공기 방울을 방지하기 위해 필수적인 주요 좋습니다.
  15. 유체가 60ml 주사기, 흐름 챔버와 주사기 펌프로 이동을 볼되면 제일 먼저 처리 해달 흐름 챔버 사용할 준비가되었습니다. 이 설정은 최대 각 셀에 입력 실행 및 필요한 각 새 접시에 대해 반복됩니다.

4. NIS 요소를 사용하여 백혈구 롤링 이벤트 캡처

  1. 바탕 화면에 열려 NIS 요소.
  2. 보도 라이브 이미지에 대한 아이콘을 "놀이". 자동 노출은 지금은 접시보다 쉽게​​ 볼 수 있도록하고 초점에 중요합니다.
  3. 현미경은 세포 monolayer에 제대로 초점을 맞추고 있는지 확인합니다.
  4. 현미경 1 프레임 / 초 및 조정 불빛에 일단 초점을 맞추고, 다시 설정 노출. 이미지가 컴퓨터에 표시하고 더 이상 낮은 조명 레벨로 인해 현미경 뷰파인더에서 확인할 수 없습니다. 라이트 히스토그램 그러면 광고 수배경 노출을 제거하거나 셀 선명도를 개선하기 justed.
  5. 동영상 캡쳐에 이상적입니다 그림을 얻기 위해 2X2 빈 또는 라이브 빈 클릭하십시오
  6. 메뉴 표시줄에서 "매크로"을 클릭하고 "포트에 쓰기"를 선택, 선택 포트 "com3,"와 "개방". (이것은 주사기 펌프와 협력하기 위해 포트를 엽니다.
  7. 다음 피펫 입력 튜브 라인 근처 5ml 테스트 튜브에 KG1a의 세포 현탁액의 1mL 및 테스트 튜브의 맨 아래에 입력 튜브 라인을 넣으십시오.
  8. 메뉴 표시줄로 이동은 "캡처"를 클릭, "시간 저속 수집."
  9. 새 메뉴가 나타납니다. 프로토콜 지속 2백10초을 선택하고,이 HBMEC - 60 세포 압연에 대한 프로그램의 길이입니다. (각 단계는 그림에게 펌프 프로토콜의 기간 동안 매초마다을하는 프로그램입니다. 또한 펌프를 시작합니다 com3 포트를 통해 명령을 보내도록 설정되어 있습니다.) 시간이 경과가 중단되면 펌프가 멈추지 않을거야 자체 및 재설정해야합니다. 이미지를 라이브로 돌아가려면 취소를 누릅니다.
  10. 사용 설명서에 따라 "프로그램 모드"로 주사기 펌프를 설정합니다. (프로그램 모드가 특정 흐름 속도 (즉, 전단 응력 수준) 챔버 내에 이수하고 HBMEC - 60 세포 monolayer 이상 KG1a 세포 상호 작용을 지시하는 수동으로 프로그래밍 가능합니다.) hBMEC 세포에서 압연 KG1a 세포에 대한 설정했던 것은 같은 4.2 다인즈을 따릅니다 / 45 S에 대한 cm 2, 0.3 다인즈 / 60 s에 대한 cm 2, stepwise 증가 매 15의 4.2 다인즈 / cm 2 최대
  11. 챔버 벽의 전단 응력 (W 일)은 다음 등식에 따라 계산 : W ST / ML의 체적 유량입니다 Q μ는 매체의 예상 점도 (0.0076 P)입니다 = 6μQ / 2 B, S는이 cm에서 채널 높이 (가스켓 두께) (0.03 ㎝)이고, B는 cm (0.5 cm)의 채널 폭입니다. 유량은 주사기 펌프의 프로그램 모드를 사용하여 규제되었습니다.
  12. 현미경과 컴퓨터는 이제 시간 저속도 촬영을 캡처하는 준비가되어 있습니다. 보도 자료를 획득 시작 컴퓨터에서 "실행 시작". 프로그램을 실행하는 동안 (기포가가 없는지 확인) 매체의 입 / 출력 튜브가 가득 유지하기 위해 KG1a 세포가 들어있는 시험관에 미디어를 추가하십시오.

5. 터미널 Sialylation 및 E - selectin - 중재 KG1a 전지 5 표면 당단백질의 의존성. (; 5.1-5.5의 비디오 클립 그림 2) 롤링

  1. 에 압연 KG1a 세포의 시금 비 자극 HBMEC - 60 세포. (대조군) KG1a 세포가 준비 이상 흐름 챔버에 주입되었다 라이브가 아닌 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 위에서 설명한.
  2. HBMEC - 60 세포를 IL - 1β와 사전 처리의 롤링 KG1a 세포의 시금. (E - selectin - 의존도 제어) KG1a 세포가 이상 흐름 챔버로 준비하고 주입되었다 라이브 IL - 1β 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60.
  3. IL - 1β 그리고 중화 방지 인간 E - selectin 모압. (E - selectin - 의존도 제어) KG1a 세포가 라이브를 통해 흐름 챔버로 준비하고 주입되었다 IL - 사전 처리 HBMEC - 60 세포에서 압연 KG1a 세포의 시금 위에서 설명한 안티 - 인간의 E - selectin 모압을 무효화와 1β 자극 HBMEC - 60 pretreated.
  4. IL - 1β 자극 HBMEC - 60의 롤링 sialidase - 소화 KG1a 세포의 시금. 37 1 시간에 대한 neuraminidase 0.1U/ml 장염 Cholerae ° C와 pretreated KG1a 세포가 이상 흐름 챔버로 준비하고 주입했다 IL - 1β 라이브 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60.
  5. IL - 1β 자극 HBMEC - 60의 롤링 프로 테아제 - 소화 KG1a 세포의 시금. 단백 분해 효소와 pretreated KG1a 세포는, 37에서 1 시간에 대한 0.2U/ml의 브로 멜 라인 ° C가 넘는 흐름 챔버로 준비하고 주입했다 IL - 1β 라이브 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60.

6. NIS - 요소 - 캡처된 KG1a 세포의 KG1a 셀 및 그래프 롤링 데이터의 분석

  1. 시간 순서가 취득 후 데이터를 저장합니다.
  2. 메뉴 표시줄에서 "측정"탭으로 이동을 선택하십시오 "임계값을 정의합니다." 원하는 세포가 붉은 색 있도록 막대를 이동합니다. "모든 이미지"다음 "자"를 선택하십시오. 전체 시간 경과 순서는 현재 보이는 붉은 구름 전지 수정해야합니다.
  3. "측정"을 선택 이동 "제한." (제한 사항은 사용자가 압연 세포를 대변하지 않습니다 thresholded 개체를 제외하실 수 있습니다. 이것은 주로 HBMEC - 60 monolayer 만든 배경입니다.) "지역"과 압연 세포에 대한 지역에 대한 입력 분 및 최대 값을 선택합니다. "신장"과이 단계를 반복합니다 "순환성합니다."
  4. "측정"을 선택하고 "제한을 사용하여 바이너리를 생성"을 선택하고, HBMEC - 60 세포 monolayer에 압연 세포의 NIS - 요소 소프트웨어 인식을 최적화하기 위해 제한 값을 설정합니다.
  5. "측정", "필드 데이터"를 선택한 다음 "초기화 데이터"를 선택으로 돌아갑니다. 이 메뉴를 닫습니다.
  6. "측정"과 SE (으)로 돌아가기"스캔 필드를"lect.
  7. 열기 "법안"은, "필드 데이터", "숫자 또는 개체"를 선택하고 "모든 필드"를 선택하고 Microsoft Excel로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
  8. 다음 데이터 수집을위한 NIS - 요소 세포 인수를 준비하는 "명확한 데이터"를 선택하십시오.

결과 :

figure-protocol-2

그림 3. KG1a 셀에서 E - selectin 바인딩 활동 병렬 플레이트 흐름 회의소 분석. sialidase이나 단백 분해 효소로 처리 KG1a 세포는 HBMEC - 60 세포를 IL - 1β와 사전 처리의 monolayers에 대한 효율성을 압연에 대해 분석했다. 실험 롤링 대조군도 아닌 IL - 1β 자극 HBMEC -60 세포 또는 압연 KG1a 세포 분석을 실시했다 IL - 1β 자극 반 인간 E - selectin 모아브 (5D11)을 중화 취급 HBMEC - 60 세포. 세포 회전 주파수는 세중의에서 수행하고 NIS - 요소 소프트웨어로 분석했다. (* 통계 의미, P는 <0.001)

physiologic 전단 응력 조건 하에서 내피 세포의 상호 작용 -이 비디오 기반의 보고서에서, 우리는 백혈구를 분석하는 방법에 대한 시각적 묘사를 제공했습니다. 백혈구 tethering을 중재하고, 같은 integrins 및 hyaluronan 수용체와 같은 수용체를 통해 중등 더 안정적인 구속력이 활동의​​ 노력에 필요한 접착제 행동을 압연에서 E - selectin 리간드 - 특히, 우리는 E - selectin의 역할을 분석. 거꾸로 현미경, 하버드 주사기 펌프, 비디오 카메라와 컴퓨터 / 셀 수집 하드웨어와 함께 사용하기위한 적응 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용하여, 우리는 실험 E - selectin 리간드 궁극적으로 실시 + KG1a 세포는 우리의 백혈구 모델과 hBMEC 세포로 사용되었다 (HBMEC - 프로 염증성 시토킨, IL - 1β로 자극 60), 우리 E - selectin + 인간 내피 세포 모델 (1-6)로 사용되었습니다. 이전에보고, 우리는에서 압연 강력한 KG1a 세포를 관찰 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 E - selectin에 의존 방식으로 (그림 3) (KG1a 세포가 압연에 비해 통계적으로 중요한 차이 전단 응력 수준의 범위에서 셀 비 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 세포). 비 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 세포에서 또는 압연 KG1a 세포로 구성되어 부정적인 컨트롤, IL - 1β 자극 반 인간 E - selectin mAb와 HBEMC - 60 세포 pretreated, 의존을 설명하기 위해 병렬로 진행되었다 롤링 활동 시토킨 자극과 E - selectin 표현 (그림 3). 비브리오 cholerae와 pretreated KG1a 세포뿐만 아니라, 압연 분석 neuraminidase (sialidase) 또는 브로 멜 라인, 표면 E - selectin 당단백질의 리간드를 소화 알려져 아닌 특정 프로 테아제와가 E - selectin 리간드에 대한 터미널 sialic 산성 잔류물 및 표면 당단백질의 중요성을 강조 활동 (2,3).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

병렬 플레이트 흐름 챔버 분석 백혈구를 공부에 사용되는 시험 관내 분석 시스템의 전문입니다 - 유사한 전단 응력 조건 하에서 내피 접착 상호 작용 후 모세관 venule의 표면에 이수 사람. 백혈구 tethering을 중재하고 활성화 microvascular의 내피의 표면에 압연에서 E - selectin 리간드 - 여기로 우리의 시각적인 표현에 묘사된, 우리는 E - selectin의 역할을 조사하는이 시스템의 가치를 보여줍니다. 우리는 또한 프로 테아제, glycosidase이 시스템에서 E - selectin과 리간드의 역할을 elucidating에 대한 차단 항체 치료의 응용 프로그램을 공개. 이러한 분석은 매우 재현성 있으며, E - selectin 연구를위한 실험적인 근거 형태 도움말 - 생체내에서 E - selectin 리간드 기능을.

시토킨 - 활성 microvascular 내피 세포 (hBMEC 또는 인간 제대 정맥이나 피부 microvascular 내피 세포)의 monolayers와 세포 부착을 공부 이외에 assays은 기판으로 재조합 E - selectin 인간 또는 E - selectin - IG 키메라 분자를 정화 사용하여 수행할 수 세포 접착하십시오. 기타 접착제 상호 작용은 백혈구 (P) (L -) - selectin 및 혈소판 - selectin은 또한 병렬 플레이트 흐름 챔버 기술을 사용하여 assayed 수 있습니다 통해 중재. 세포 monolayer / 단백질 기판의 종류를 변화하거나 입력 백혈구 / selectin - transfectant 세포 모델의 조사는 physiologic 전단 응력 조건 하에서 이러한 상호 작용의 역할을 공부할 수 있습니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
저자는 관심이나 공개에 대한 충돌이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

건강 / 미 국립 암연 구소 (NCI) 그랜트 (찰스 J. Dimitroff에 RO1CA118124)의 국립 연구소,,이 프로젝트에 대해 자금은 미국 암 협회의 연구 학술 상, (찰스 J. Dimitroff에 06-024 - 01 - CSM)에 의해 제공되었으며 관절염과 Musculoskeletal 보건 / 국립 연구소 및 피부 질환 부여의 국립 연구소 (박사 토마스 S. Kupper에 P30 AR042689, 브리검 앤드 위민스 병원, 보스톤, MA).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FBSSigma-AldrichF6178-500ML
DPBSGIBCO, by Life Technologies14190
0.5 M EDTAGIBCO, by Life Technologies15575-038
1M HEPESGIBCO, by Life Technologies15630
병렬 플레이트 플로우 챔버 키트GlycoTech31-001
PHD2000 프로그래밍 가능 주사기 펌프하버드 장치PHD 2000
35x10mm 조직 배양 접시BD Biosciences353001
Fibronectin, 인간 플라즈마Sigma-Aldrich86088-83-7 F2006-2MG
Interleukin-1_, 인간; 재조합시그마-알드리치I9401-5UG
HBSS(행크의 완충 식염수 용액)GIBCO, 라이프 테크놀로지14170
매체 199 w/ HEPES & 글루타민인비트로젠12320-039
인간 혈청혁신적인 연구, Inc.IPLA-SER1
HeparinAbraxis BioScience504011
재조합 인간 섬유아세포 성장 인자R& D 시스템233-FB
페니실린 스트렙토마이신GIBCO, 생명 기술15140
플라스틱 시험관BD 생명과학352008
안티 휴먼 E-셀렉틴 클론 BBIG-E4(5D11)R& D 시스템BBA16
브로멜라인시그마-알드리치B-4882
스

References

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