측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명

요약

이 문서에서 우리는 UV - 살해 박테리아 음식 고체 미디어에 유지 nematodes의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

초록

노화는 세포의 구성 요소와 사망률의 결과 organelles의 점진적 저하 특징 퇴행성 과정이다. 선충류

프로토콜

1 부 : 준비 선충류의 성장 미디어 (NGM) 접시

이 섹션은 수명 실험에 사용하기 위해 고체 NGM 플레이트의 준비에 대해 설명합니다. 암피실린 (앰프)와 NGM에 추가 fluorodeoxyuridine (FUDR)를 모두 가지고 아무런 첨가제 및 앰프 / FUDR 접시를 포함하지 표준 NGM 번호판, : 기본 수명 실험은 접시 두 가지 유형이 필요합니다. 암피실린 외국 세균 오염을 방지하는 데 사용됩니다. FUDR은 세포 분열을 억제 계란 생산을 감소하고, 부화에서 계란을 방지할 수 있습니다. 장수 분석을위한 FUDR의 사용은 성인 수명에 영향을 성장 유충에서 분리하기 위해 모든 며칠 벌레를 전송하는 필요를 제거하지 않습니다. 접시의 두 종류 E. 함께 씨앗 아르 이후 UV에 노출에 의해 살해 대장균 박테리아 OP50.

1. NGM (조리법 및 스토리지 노트 섹션 5 참조)와 레이블 배양 접시를 준비합니다. 당신은 NGM 10 ML 당 1 60mm 페트리 접시가 필요합니다. 당신이 이전에 준비 고체 NGM 시작하는 경우, 1.2 단계로 진행합니다. 당신은 갓 autoclaved NGM 시작하는 경우, 1.4 단계로 건너 뜁니다.
2. 완전히 30초 펄스의 높이 microwaving하여 고체 NGM을 용융. 최대 건물에서 가압 가스 거품을 방지하기 위해 펄스 사이의 소용돌이 미디어.
3. 55 ° C 물 목욕이나 냉각 벤치에 자리 액체 NGM.
4. 일단 NGM 55에 도달 ° C 150 MM의 FUDR 33 μL과 100 MG / ML 100 ML NGM 당 암피실린 (앰프 / FUDR 접시)와 섞어 소용돌이 100 μL를 추가합니다. 추가 약물없이 NGM 접시에 대한 1.5 단계로 바로 진행합니다.
5. 각 60mm 배양 플레이트에 살균 기법, 피펫 10 ML NGM을 사용합니다. 가능하면 거품을 형성하지 마십시오. 거품이 양식을 할 경우, 그들은 피펫 팁을 사용하여 쐈고 수 있습니다.
6. NGM은 응고 및 건조 수 있도록 뚜껑에있는 벤치에 접시를 남겨주세요. 가능하면, 박테리아를 추가하기 전에 2 일간 벤치에 번호판을 떠나지만, 접시가 빨리 필요하면 일일 작동합니다.
7. 당일 번호판 E.의 신선한 행진에서 하나의 식민지로 건조, 종자 액체 LB 문화를 완료하기 전에 LB 한천에서 대장균 박테리아를 OP50. 당신은 60mm 판 당 하룻밤 OP50 문화의 최소한 1 ML 준비를해야합니다.
8. 37 장소 OP50 문화 박테리아 (문화 포화에 도달한다) 하룻밤 성장 ° C 뿌리와이 가능하다는 특징을 가지고있다.
9. 펠렛 OP50 10 분 3,500그램에서 회전에 의해 박테리아.
10. 문화 10X 집중 뜨는 및 resuspend 박테리아의 90 %를 제거합니다.
11. 확정 NGM 플레이트의 중심에 10X 집중 OP50 문화의 피펫 100 μL. (이상적으로 박테리아가 판 벽 근처에 오는없이 NGM의 중심 영역을 커버한다) 필요할 경우 소용돌이의 번호판은 부드럽게 박테리아 문화를 확산합니다. 미디어의 표면에 결함이 NGM로 버로우로 벌레를 허용 등 NGM의 표면에 피펫 팁을 만지는 피하기 위해보십시오.
12. 박테리아 문화가 고체 NGM (일반적으로 약 24 시간 소요)에 건조 수 있도록 밤새 벤치에 접시를 남겨주세요.
13. 일단 건조하고 박테리아의 성장을 체포하는 데 충분한 UV 복용으로 접시의 표면을 쉽게받을 수 있습니다. 당신은 Stratagene의 자외선 Stratalinker 2400을 사용하는 경우 :
    • 플레이스 Stratalinker에 접시와 뚜껑을 제거
    • 문을 닫고 Stratalinker 켜십시오
    • 보도 자료 '에너지'
    • '9999 '은 키패드를 사용하여 입력
    • 누르면 '시작'
    • 플레이트는 약 5 분 동안 자외선에 노출됩니다
14. UV - 살해 박테리아와 플레이트는 ° C 최대 1 개월 4에서 거꾸로 저장할 수 있습니다.

2 부 : 동물의 연령 동기 인구를 얻기 누워있는 시간이 초과되었습니다 달걀을 수행

이 섹션에서 우리는 공통의 해치 - 날짜와 웜의 인구를 생성합니다. 이것은 reproductively 활성 성인 시간 정의된 기간 동안 접시에 알을 낳을 수 있도록 이들 계란 개발함으로써 수행됩니다.

1. (선택 사항) FUDR없이 신선한 NGM 접시에 약 20 젊은 성인 웜을 전송합니다. ° C 웜은 세균성 음식의 모든을 통해 전파하고 먹을 수 있도록 25 접시를 남겨주세요. 세균성 음식 섭취 후에는 새로 부화 벌레는 dauer 단계를 체포 성장을 입력합니다. 당신은 처음 접시로 전송 얼마나 많은 벌레에 따라 일주일 이내 주변 dauer의 유충을 볼 시작합니다. Dauer의 유충은 최대 1 개월 다음 단계에 사용할 수 있습니다.
2. FUDR없이 신선한 NGM 접시에 (옵션) 전송 20-30 dauer의 유충. 식품 dauer의 유충의 존재 2 일 이내에 reproductively 활성 성인이 될 것이며, 25 이후 며칠 동안 reproductively 활성 상태로 유지 ° C.가
3. FUDR없이 신선한 NGM 접시에 10-15 reproductively 적극적인 성인을 전송합니다. 이 번호판은 시간 초과 에그 누워 (전화) 번호판이라고합니다.
4. ° C 6 시간 t를 허용하기 위해 25 TEL 접시를 남겨주세요그는 벌레 시간은 알을 낳기 위해.
5. TEL 플레이트에서 어른 벌레를 제거합니다. 플레이트는 시각 성인 제거하기 전에 달걀에 대한 검사를하실 수 있습니다. 벌레가 알을 충분한 숫자를 마련하지 않은 경우 TEL 판은 어른 벌레를 제거하기 전에 24 시간 총 최대 25 ° C에서 남아있을 수 있습니다.
6. 20 장소 TEL 판 ° C 계란이 부화하고 벌레가 L4 애벌레 단계 (이것은 일반적으로 야생 유형 C. 엘레간스 2 일이 소요하지만, 속도가 느린 개발 phenotypes와 종자에 대한 더 오래 걸릴 수 있습니다)을 개발하기 전까지.

파트 3 : 수명에 대한 점수 동물

그들은 죽을 때까지이 섹션에서 우리는 2 부에서 벌레의 시대 - 동기 인구를 수행합니다. 웜가 계란 생산 및 박테리아 오염을 방지하기 위해 앰프 / FUDR 접시에 유지되며 외부 자극에 반응하지 않는 경우 죽은 것으로 간주됩니다.

1. 씨앗 앰프 / FUDR 접시에 L4 유충을 전송합니다. 각각의 변형이나 조건이 테스트되는 경우, 그것은 접시마다 25-30 벌레와 2-3 접시를 설정하는 것이 일반적입니다. C. 이미지 엘레간스 생활 단계는 참조 (그림 1)를 제공합니다 ^1.
2. 20 플레이스 앰프 / FUDR 접시 ° 24 시간 동안 C.
3. 24 시간 후에, 시각 웜, 미디어, 그리고 박테리아를 평가. 다음 중 하나를 관찰하는 경우 신선한 앰프 / FUDR 접시에 웜을 전송 :
   • 웜는 세균 음식의 대부분을 먹었. 조기 수명의 실험 웜을 1로 2 배에게 고갈되는 세균을 방지하기 위해 일주일을 전송해야합니다.
   • 애벌레의 상당수가 존재하고 있습니다. 이것은 일반적으로 벌레가 젊은 성인 대신 L4s로 앰프 / FUDR 접시에 전송하고 FUDR이 효과를 데려가기 전에 몇 알을 낳을 수 있었던 것을 나타냅니다. FUDR은 일반적으로 전체 성인으로 성장의 애벌레를 방지할 수 있지만, 가끔 몇 어른으로 성장하고 실험 동물과 혼동이 될 것입니다.
   • 라이브 / 성장 세균이 관찰됩니다. 일반적으로 앰프와 UV - 살인의 조합은 사는 박테리아가 실험을 오염하지 않도록되지만 종종 발생합니다.
   • 곰팡이 성장은 미디어에 관찰됩니다. 초기 충분히 잡는다면, 곰팡이 성장은 일반적으로 피펫 팁 또는 주걱을 사용하여 잘라하실 수 있습니다. 일단 그것은 직경이 새 접시에 벌레를 전송하는 일반적으로 쉽게 몇 mm보다 큰 수 자랍니다.
   • 절개 범위를 사용하여, 각각의 벌레가 살아 있거나 죽어 있는지 확인합니다.
   • 부드럽게 접시를 누릅니다. 그것은 감​​청에 대한 응답으로 이동하면 웜이가 살아있다는 의미이다.
   • 웜은 머리 지역에있는 판, 줌 감청에 응답하지 않는 경우.
   • 부드럽게 플래티넘 전송 선택으로 벌레의 머리를 누릅니다. 그것의 머리를 이동하여 응답하지 않으면 죽은 벌레를 점수.
   • 죽은 벌레는 접시에서 제거할 수 있습니다.
4. 살아 죽은 날짜와 벌레의 수를 기록합니다.
5. 20 ° C.에 접시로 돌아가기
6. 모든 벌레가 죽었을 때까지 반복 3.3 3.6를 통해 모든 2~3일 단계를 반복합니다.

4 부 : 대표 결과.

선충류의 수명 실험에 의해 만들어진 원시 데이터 테스트 각 변형에 대한 살아있는 죽은 벌레의 해당 숫자와 날짜의 목록입니다. 매일 죽는 벌레의 수는 일반적으로 생존 곡선 (그림 2B로 그래픽 꾸몄다는 매일 살아있는 벌레의 비율 (그림 2A), 계산하기 위해 거꾸로되며 시간 초과 에그 누워 당일 것은 일 0로 간주됩니다 ). 연구의 각 웜에 대한 수명은 매일 죽는 벌레의 개수의 계산과 변종 사이의 비교에 대한 의미와 중간 수명을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 매일 살아있는 벌레의 수를 셀 수명 분석에 직접 사용되지 않습니다. 고체 미디어에 유지 벌레는 때로는 '도망'또는 언론 아래 접시 또는 아래의 벽까지 중 크롤 링합니다. 매일 살아있는 벌레의 수는 얼마나 많은 벌레들이 실험 과정을 통해 도망 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 도망 웜은 일반적으로 분석에서 제거됩니다. N2, C.위한 벤치 마크로서, 전형적인 중간 수명 20 UV - 살해 박테리아에서 유지 엘레간스 야생 형 변형, ° C는 난자에서 측정한 약 25 일입니다.

제 5 부 : 솔루션

선충류 성장 미디어 (NGM), 100 ML :
컴바인 :
0.3 g	NaCl
0.25 g	펩톤
2g	한천
40 분 압력솥과 55 식지는 ° C, 다음 추가 :
100 μL	1 M MgSO 4
100 μL	5 MG / ML 콜레스테롤
100 μL	1 M CaCl2
1.625 ML	1.5 M KPI의 산도 6.0
액체 NGM는 실온에서 번호판을 부어 즉시 사용되거나 응고 허용 및 장기 저장할 수 있습니다

Luria 맛을 (LB), 1L :
10g	BactoTryptone
5g	효모 추출
10g	NaCl
10 ML	1 M 트리스 산도 8.0
1 L	탈이온수
압력솥과 실온에서 저장합니다.

1 M MgSO 4, 300 ML :
73.95 g	MgSO 4
300 ML	탈이온수
압력솥과 실온에서 저장합니다.

5 MG / ML 콜레스테롤, 200 ML :
1g	콜레스테롤
200 ML	100 % 에탄올
소독 필터 및 실내 온도에 저장합니다.

1 M CaCl 2, 500 ML :
27.75 g	CaCl 2
500 ML	탈이온수
소독 필터 및 실내 온도에 저장합니다.

1.5 M KPI 산도 6.0 1L :
컴바인 :
31.4 g	KPI 이염
179.6 g	KPI 일염기의
850 ML	탈이온수
히트 KPI는 솔루션으로 분해하도록 혼합하는 동안. 10 N NaOH와 6.0 산도를 조정합니다.
1 L.에 탈이온수 추가
압력솥과 실온에서 저장합니다.

1 M 트리스, 산도 8.0 :
60.57 g	트리스
400 ML	탈이온수
HCL과 8.0 산도를 조정합니다.
500 ML에 탈이온수를 추가합니다.
소독 필터 및 실내 온도에 저장합니다.

150 MM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 ML :
0.3693 g	FUDR
10 ML	무균 탈이온수
-20 ° C.에 저장

100 MG / ML 암피실린 (앰프), 10 ML :
1g	암피실린
10 ML	무균 탈이온수
-20 ° C.에 저장

50 MG / ML Carbenicillin (수화물), 10 ML :
500 MG	Carbenicillin
10 ML	무균 탈이온수
-20 ° C.에 저장

1 M 이소 프로필 β - D - Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ML :
2.38 g	IPTG
10 ML	무균 탈이온수
-20 ° C.에 저장

C. 그림 1. 명시야 이미지 달걀을 포함 엘레간스 생활 단계, 네 개의 애벌레 단계 (L1 - L4) 및 성인. 모든 패널은 성인 남성 (우드 (1988)에서 이미지) 보여주는, 오른쪽 아래를 제외하고 나온것을 보여줍니다.

C.에서 그림 2. 대표 결과 엘레간스 수명 실험은 DAF - 2 유전자에 돌연변이 포함된 변형으로 야생 유형 변형 N2를 비교. (A) 수집 벌레가 알을 이후 일수를 포함하여 데이터, 매일 관찰 죽은 벌레의 수를, 그리고 매일에 살아 남아있는 원래의 샘플의 비율 (죽은 벌레의 일상 건의부터 계산) 보여주는 표 . (B) 생존 (A)에서 제공하는 수명 데이터에 해당하는 곡선.

그림 3. 젊은이와 노인 성인 C. 사이 lipofuscin 대표 비교 엘레간스. 명시야 이미지는 오른쪽 왼쪽 채널 DAPI 형광 이미지에 표시됩니다. 상단 패널은 사일 오래된 웜 및 바닥 패널 (같은 난자에서 측정) 11일 오래된 벌레를 보여 보여줍니다.

토론

장수 유전자 제어 C. 광범위하게 연구되어 수명을 확인할 수있는 쉽고 인텔리로 주로 인해 엘레간스. 본 문서에서 언급한 다른 프로토콜은 C로 재현성 수명 데이터를 얻기위한 기본 프레임 워크를 설명 엘레간스하며 relatednematode 수종에도 적용할 수 있습니다. ² 이러한 절차는 다양한 조건 하에서 수명을 측정하기 위해 적응 수있는 몇 가지 간단한 변경을함으로써. 여기 우리는 RNA 간섭 (RNAi), 세균의 박탈에 의해식이 제한, 그리고 약물없는 NGM, 라이브 박테리아를 포함한 몇 가지 일반적인 변형을 설명합니다.

아마이 프로토콜의 가장 일반적인 변형 라이브 박테리아에 벌레의 유지이다. 이것은 몇 가지 사소한 변경하여 수행할 수 있습니다. 첫째, 세균 (1.13 단계 1.7)와 접시 시딩위한 절차를 변경합니다. 대신 포화에 OP50 문화를 성장, 200 μL의 액체 문화에서 직접 접시...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가르	시약	피셔 사이언티브	DF0145-17-0 (214530)
암피실린	시약	중과학	0339
박토트립톤	시약	피셔 사이언티브	DF0123-17-3 (211705)
박토펩톤	시약	피셔 사이언티브	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	시약	피셔 사이언티브	NC9699248 (1332-01)
카르베니실린	시약	골드 바이오테크놀로지	C0109
콜레스테롤	시약	시그마-올드리치	C75209
플루오로디옥시우리딘 (FUDR)	시약	시그마-올드리치	F0503
Isopropyl β-d-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)	시약	골드 바이오테크놀로지	I2481C5
KPi Dibasic	시약	피셔 사이언티브	5087862 (3252-01)
KPi 모노베이직	시약	피셔 사이언티브	5087861 (3246-01)
MgSO4	시약	피셔 사이언티브	NC9561800 (2500-01)
나클	시약	피셔 사이언티브	S251
트리스	시약	시그마-올드리치	T1503
효모 추출물	시약	피셔 사이언티브	DF0886-17-0 (288620)