방법 논문

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

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DOI:

10.3791/1229

⸱

2009년 3월 25일

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University

이 논문에서

요약

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

프로토콜

1. 정치

  1. 4 박 배아 ° C PBS에 4 % paraformaldehyde (PFA)와. 문제를 해결
  2. 삭제 수정하고 실온 (RT)에서 2 X PBS 5 분 각각 씻으십시오.
  3. 시계 제조인의 집게를 사용하여 유리 우울증 플레이트의 PBS에서 수동으로 dechorionate 배아. 그들은 폴리 프로필렌의 pipettes에 충실 수 있으므로 dechorionation 후, 배아는 불을 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 전송됩니다.
  4. 오분 각 25 %의 일련의 50 %와 PBS의 75 % 메탄올을 통해 배아를 전송합니다.
  5. 100 % 메탄올로 액체를 교체, 새로운 메탄올로 교체 후 5 분 부화합니다.
  6. 1 시간 최소 -20 ° C에서 장소 배아. (우리는 일반적으로 현장 하이브 리다이 제이션의 표준은 년 이상 보관 배아에서 작동합니다. 하룻밤 배아를 품어,하지만 우리는 현장 하이브리드화에 형광의 높은 해상도가 장기간 보관하여 분실 여부를 검사하지 않았습니다.)
  7. 75 % 오분 각각 50 %, RT에서 PBST에서 25 %의 메탄올을위한 배아를 씻으십시오. RT에서 오분 PBST에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오.
  8. RT에서 PBS에 4퍼센트 PFA에 20 분 다시 수정.
  9. RT에서 오분 PBST에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오.

PFA에 관한 참고 :
우리는 (시약의 표 참조) -20 º C에서 aliquots에 4% PFA를 저장합니다. 초기 고정을 위해, 우리는 이전에 해동 적이있다는 PFA를 사용합니다. 이후 fixations 들어, 우리는 종종 이전 해동했다는 PFA를 사용합니다. 초기 고정이 절차를 성공적으로 얼룩을 위해 중요한 것 같습니다.

2. PROTEINASE 및 POSTFIXATION

  1. 배아를 permeabilize하는 3~12분에 대한 RT에서 proteinase K (PBST에 5μg/ml)와 다이제스트. (부화 시간은 젊은 단계 더 구분으로 태아의 나이에 따라 달라집니다. 또한 효소의 배치에 따라 다릅니다.) somitogenesis 스테이지 배아의, 우리가 일반적으로 3~4분에 대한 permeabilize. 이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다.
  2. PBST에서 잠시 씻어 ​​PBST로 5 분 한 번 씻는다.
  3. RT에서 PBS에 4퍼센트 PFA에 20 분 다시 수정.
  4. RT에서 PBST로 5 분 각각 두 번 씻으십시오.

3. PREHYBRIDIZATION

  1. 65 º C에서 5 분 동안 태아를 품어 HYB -.
  2. HYB에 최소한 1 시간 동안 65 º C에서 Prehybridize +.

4. 이종 교잡

  1. 제외한 모든 preHYB 50 μl를 제거하지만, 완전히 빠져들 배아를 보관해야합니다.
  2. 부드럽게 튜브 flicking하여 배아와 혼합 각 riboprobe 1-2 μl (digoxygenin 및 플루오레신 - 레이블 riboprobes)를 추가합니다. 프로브의 양은 일반적으로 20μl 프로브 합성 반응에서 1 2μl입니다.
  3. 플루오레신가 빛을 민감한 것을 감안할 때, 튜브는 알루미늄 호일에 싸서 또는 기타이 시점에서 최소한의 빛에 노출되어야합니다.
  4. 65 º C.에서 하룻밤 배아를 품어

5. 프로브 제거

참고이 시점 전달 부족 세제의 솔루션을 제공합니다. 세제의 제거는 얼룩 반응을 도와 나타나지만 배아는 오히려 끈적이 될 원인 않습니다.

  1. riboprobe를 제거합니다.
  2. 50 % formamide/2xSSC 65 º C에서 2 X 30 분 씻으십시오.
  3. 2 X SSC 65 º C에서 15 분 동안 씻으십시오.
  4. 0.2 X SSC 65 º C 30 분 씻으십시오.

6. 안티 플루오레신 항체 보육

  1. 1X maleic 산성 버퍼 플러스 2% 차단 시약 (시약의 표 참조)의 솔루션을 500μl의 RT 적어도 1 시간 차단합니다.
  2. 차단 솔루션의 1:500 희석에로 로체가 제공하는 안티 - 플루오레신 - POD 항체를, 추가합니다.
  3. 4 º C.에 밤새 품어 이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다.
  4. 1X maleic 산성 버퍼 4 X 20 분 씻으십시오. 오분 PBS에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오.

7. 플루오레신 - LABELLED 프로브 탐지

  1. TSA 플러스 플루오레신 솔루션 30-60분을 품어. (반응하십시오. 얼룩 솔루션을하기 전에 TSA 기판 스핀 다운 tyramide 시약에게 퍼어킨 엘머 증폭 희석제 버퍼에 1시 50분을 희석.)이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다. 반응 시간은 각 프로브에 대해 경험적으로 결정되어야합니다. 불행히도, 얼룩 반응은 기판이 형광 그대로 시각적으로 모니터링할 수 없으며, 하나는 얼룩 반응에 걸쳐 유비 쿼터스 녹색 형광을 볼 수 있습니다.
  2. 30 %, 50 %, 75 % 및 PBS의 100 % 메탄올 10 분만에 각 씻으십시오.
  3. 첫 번째 퍼옥시데이즈를 inactivate 30 분 메탄올에 1% H 2의 해결책 0 2에서 품어.
  4. 75 % 50 % PBS에 30 % 메탄올 10 분만에 각 씻으십시오. 다음 십분 PBS에서 각각에 대해 두 번 씻는다. 그것은 중요하다는 것을 충족의 모든hanol이 제거됩니다.

TYRAMIDE 신호 증폭주의 사항 :
우리는 퍼어킨 엘머 TSA 키트를 사용하여왔다. 우리는 알렉사 - Tyramide 기판은 퍼어킨 엘머 증폭 희석제 버퍼를 사용하여 잘 얼룩 발견하지만, 우리는 Invitrogen / 분자 프로브 키트와 함께 제공되는 얼룩 버퍼를 사용하여 성공을 없었어요. 마지막으로, 우리는 플루오레신와 알렉사 - 647은 영향을받지있는 동안 Cy5 형광이 이후 메탄올 / H 2 O 2 치료에 의해 ​​제거 것으로 나타났습니다. Cy3 또한 부정적인 그것이 구조적으로 관련되어 Cy5로 메탄올 / H 2 O 2 치료에 의해 ​​영향을받을 수 있습니다. 이러한 이유로, Cy3과 Cy5 TSA 반응은 현장 프로토콜에서 두 형광의 두 번째 얼룩 반응을 위해 사용해야합니다.

8. 안티 Digoxygenin 항체 인큐베이션

  1. 1X maleic 산성 버퍼 플러스 2% 차단 시약의 용액에 RT 적어도 1 시간 동안 다시 배아를 차단합니다.
  2. 위의 솔루션을 차단에서 1:1000 희석에 로체 제공한으로 방지 발굴 POD 항체 추가
  3. 4 º C.에 밤새 품어 이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다.
  4. 1X maleic 산성 버퍼 4 X 20 분 씻으십시오. 오분 PBS에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오.

9. Digoxygenin - LABELLED 프로브 탐지

  1. (얼룩 솔루션을하기 전에 TSA 기판 스핀 다운. 반응의 경우, 증폭 희석제 버퍼에 tyramide 시약 1시 50분을 희석) TSA에 30~60분 플러스 Cy5 솔루션을 품어이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다. 반응 시간은 각 프로브에 대해 경험적으로 결정되어야합니다.
  2. 십분 PBST 각 세 번 씻으십시오.

10. PROPIDIUM의 요오드화물 얼룩

  1. 오분 2 X SSC에 각각에 대해 두 번 씻으십시오.
  2. 37 30 분 배아를 품어 ° 10 μl RNAse (100μg/ml의 최종 농도에 대한)과 함께 50 μl 2 X SSCT에서 C.
  3. 삼분 RT에서 2 X SSC에 각 6 번 씻으십시오.
  4. 2 X SSC에 330μg/ml propidium 요오드화물의의 솔루션에 8 분 동안 배아를 얼룩.
  5. 삼분 RT에서 2 X SSC에 각 6 번 씻으십시오.
  6. RT에서 PBS에 4퍼센트 PFA에 20 분 수정.
  7. RT에서 PBST로 5 분 각각 두 번 씻으십시오.

11. 설치

  1. 십분 25% 각과 PBST에 50 % 글리세롤을위한 배아를 품어. 4 º C.에 75 % 글리세롤에서 하룻밤 지우기
  2. 우리는 해부하다와 deyolk 배아과 평면 현미경 슬라이드에 그들을 탑재합니다. 난황은 상당한 배경 형광을 생성할 수 있습니다. 절개는 배아가 gylcerol에 ovenight 해제 후 훨씬 쉽습니다.

솔루션 :

PBST PBS 플러스 0.1 % 트윈
SSCT SSC 플러스 0.1 % 트윈
HYB - 50 % 포름 아미드
5xSSC
0.1 % 트윈 - 20
HYB + HYB -
5mg/ml torula (효모) RNA
50μg/ml 헤파린 		torula RNA는 RNA로의 proteinase K의 소화에 의해 준비가되어 이후 페놀 -, 페놀 - 클로로포름 - 및 클로로포름 - extraction.The RNA가 시켰던 및 DEPC - 처리된 물속에 녹아있다.
1 X maleic 산성 버퍼 150mM maleic 산, 100mM NaCl (산도 7.5)

figure-protocol-1

그림 1. 원위치 하이브리드화의 전체 마운트 대표 결과가 이중 형광. (AC). 이미지는 10 - 체절 단계에서 zebrafish 배아의 후부 지역을 통해 하나의 공촛점 섹션을 표시합니다. 보기 맨 앞쪽에와 지느러미입니다. propidium 요오드화물의와 핵의 얼룩진 색 파란색입니다. (A) deltaC의 mRNA는 digoxygenin - 표시 riboprobe 및 TSA - Cy5 시약을 사용하여 검색했습니다. (B) her1 유전자의 mRNA 베꼈는데 것은 플루오레신 - 표시 riboprobe 및 TSA - 플루오레신 시약과 함께 발견되었다. (C) 녹색과 적색 채널을 병합하면 unambiguously 두 유전자의 서로 다른 또는 중복 유전자의 표현의 영역을 식별합니다. (D, E) her1 표현의 상세는이 절차의 높은 해상도를 보여주는. mRNA의 Subcellular 지방화 명확하게 분별 수 있습니다. 화살촉은 핵에 얼룩의 점에 의해 밝혀 적극적인 전송을 전시 세포를 나타냅니다. 화살표는 mRNA의 세포질 지방화를 보여주는 세포를 나타냅니다. her1 및 deltaC에 대한 (F, G) 더블 얼룩이 두 유전자 (흰색 화살촉) 또는 별도로 유전자 (빨간색과 녹색 화살촉) 중 하나를 해독 아르 세포를 보여줍니다.

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토론

여기에 제시된 프로토콜은 일반적인 알칼라인 포스파타아제 매개 반응에서 30-45분간 염색 후 깨끗하고 강한 신호를 나타내는 프로브에 효과적입니다. 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization) 프로토콜을 수행하기 전, 당사는 항상 표준 비형광 프로토콜(프로브 합성 프로토콜과 함께 보충 자료로 제공됨)을 사용하여 프로브를 테스트합니다. 신호가 약한 프로브를 사용할 때는 형광 인시튜 하이브리다이제이션 프로토콜의 성공률이 낮았으나, 일부 경우에는 가능할 수도 있습니다. 당사는 형광 인시튜 하이브리다이제이션 프로토콜을 β-catenin 3의 면역국소화(immunolocalization)와 성공적으로 결합하였습니다. 이 변형법을 수행할 때는 낮은 온도에서 에피토프가 더 잘 보존되는 것으로 보이므로, HYB-, HYB+ 및 하이브리다이제이션 배양을 65°C 대신 55°C에서 진행합니다. 면역국소화 배양은 TSA 반응 후에 수행합니다.

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감사의 글

우리는이 프로토콜을 개발 Dörthe Jülich, 제니퍼 라운드와 앤드류 마라의 기여를 인정하고 싶습니다. NICHD, 미국의 암 사회와 천의 월에서 제공하는 연구 지원합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Paraformaldehyde 16% 용액, EM 등급Electron Microscopy Sciences157101.33x PBS에서 4%로 희석(최종 1x). 2ml씩 분주하여 –20°C에 보관
Proteinase K, recombinant PCR 등급Roche Group03115879001증류수에 20mg/ml 스톡 용액을 제조. 1ml씩 분주하여 –20°C에 보관
Blocking ReagentRoche Group110961760011x maleic acid 완충액으로 10% 스톡 용액을 제조. 50ml씩 분주하여 –20°C에 보관. 여러 번의 동결-해동 과정 후에도 안정함.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragmentsRoche Group11426346910분주하여 -20°C에 보관. 사용 중인 분주액 하나는 4°C에 보관.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragmentsRoche Group11207739910위와 동일.
TSA Plus Fluorescein 시스템PerkinElmer, Inc.NEL741001KTTSA 시약의 각 바이알은 필요할 때만 준비. 60μl DMSO에 용해. 4°C에 보관.
TSA Plus Cyanine5 시스템PerkinElmer, Inc.NEL745001KT위와 동일
TSA Plus Cyanine3 시스템PerkinElmer, Inc.NEL744001KT위와 동일
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)Molecular Probes, Life TechnologiesT20926tyramide 시약을 150μl DMSO에 용해한 후 분주하여 –20°C에 보관.
RNase, DNase freeRoche Group11119915001500μg/ml 용액으로 공급됨
Propidium IodideMolecular Probes, Life TechnologiesP-3566증류수에 1mg/ml 용액으로 공급됨.

참고문헌

  1. Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
  2. Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
  3. Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  4. Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
  5. Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).

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