마우스 부신 Chromaffin 셀 절연

요약

부신 골수의 chromaffin 세포 배양 시스템은 체외 설정에의 자극 - 분비 커플링 연구를 위해 매우 유용합니다. 이 프로토콜은 adrenals을 해부하다 다음 부신 피질 멀리 벗겨진하여 골수의 영역을 분리하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 단일 chromaffin 세포로 골수의 소화는 다음 증명됩니다.

초록

부신 골수의 chromaffin 세포 배양 시스템은 체외 설정에의 자극 - 분비 커플링 연구를 위해 매우 유용합니다. 이 프로토콜은 adrenals을 해부하다 다음 부신 피질 멀리 벗겨진하여 골수의 영역을 분리하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 단일 chromaffin 세포로 골수의 소화는 다음 증명됩니다.

프로토콜

약어 :
ACCs - 부신 Chromaffin 세포, E. Soln - 효소 솔루션, E. DMEM - 풍부한 Dulbecco의 수정된 이글 매체

1. 준비
   1. E. Soln (40 단위 papain / 1ml E. Soln.) 중 원하는 수량에 papain을 추가합니다.
   2. 얼음 약 15 분 carbogen와 papain을 활성화합니다. 산소 로크의 얼음 버퍼뿐.
      
2. 해부
   1. 80~10주 마우스를 사용합니다.
   2. 제거 소화하기 전에 로크의 버퍼와 얼음 장소 산소.
   3. 절개 절차에 대한 비디오를 참조하십시오.
   4. 일단 excised에서 장소 땀샘은 로크의 버퍼를 산소.
      
3. 수유기의 준비
   1. 글랜드에서 지방 제거합니다.
   2. 글랜드에서 피질을 스트립.
      
4. 효소 소화
   1. 무균 필터 papain을 산소.
   2. 배양 접시에 산소 papain 네 가지 풀을하십시오.
      1. 3 수영장 100uls에 대해해야합니다.
      2. 수영장의 1 400uls에 대해해야합니다.
   3. 풀을 통해 medullae 와시
      1. 3 100ul 수영장으로 첫번째.
      2. 다음 400ul 수영장을 통해
      3. microfuge 튜브에 400ul 수영장에서 Pippette 300ul E. Soln와 모수의 조각.
      4. 37 microfuge 튜브 및 장소에 Qrap parafilm ° C 20 분에 대한 물 목욕.
      5. papain을 포함한 산소 나머지 E. Soln 계속 잊지 마십시오.
      6. 후 이십분 살균 필터 더 E. Soln.
      7. 새로 필터링 E. Soln와 오래된 E. Soln의 입욕 medullae를 교체합니다.
         
5. Triturations
   1. 기음과 E. Soln을 삭제.
   2. 1ml E. DMEM에 medullae 씻으십시오.
   3. 기음과 E. DMEM을 삭제.
   4. 1ml 팁과 300ul E. DMEM과 씹다 20X를 추가합니다.
   5. 무균 면도날로 200ul 팁 컷.
   6. 컷 200ul 팁 5 - 10X 씹다.
   7. E. DMEM의 입욕 medullae 조각을 폐기하십시오. 매체 파편이 포함됩니다.
   8. 조각 medullae하는 300uls 신선한 E. DMEM을 추가합니다.
   9. 200ul 팁 20x와 씹다
   10. Pippette E. DMEM는 튜브 withough medullae 조각을 microfuge 수 있습니다. 매체 무료 ACCs이 포함됩니다.
   11. 조각 medullae하는 300uls 신선한 E. DMEM을 추가합니다.
   12. 23.5 게이지 주사기 바늘 20x와 medullae를 씹다.
   13. 두 triturations에서 E. DMEM을 결합합니다. Medullae 조각은 존재하지 않아야 지금 featherlike 모습이 있어야합니다.
       
6. 도금
   1. 3.7g S.에서 2.5 분 마지막 두 분쇄 단계에서 Microfuge E. DMEM
   2. 후속 실험에 따라 50uls - 200 E. DMEM에 Resuspend 펠릿.
   3. 플레이트 유리 coverslip 10 - 30uls.
   4. 준수하는 세포 15 분 동안 기다리십시오.
   5. E. DMEM의 750uls를 추가합니다.