단백질 Ubiquitination의 감지

요약

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜 설명 생체내에 테스트 튜브 체외에서.

초록

Ubiquitination, 단백질을 타겟으로 polypeptide ubiquitin의 공유 결합 첨부 파일 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 그들은 ubiquitin - 활성화 효소 E1, ubiquitin - 결합 효소 E2, 그리고 ubiquitin ligase의 E3를 포함합니다. E1과 E2, E3 ubiquitin ligases 디스플레이 기판 특이성을 달리. 한편, 수많은 deubiquitylating 효소는 polyubiquitinated 단백질을 처리하는 역할을합니다. Ubiquitination 단백질의 안정성, 휴대 현지화, 그리고 생물 학적 활동의 변화가 발생할 수 있습니다. ubiquitination / deubiquitination 경로 또는 변경 ubiquitin 시스템 기능에 관련된 유전자의 돌연변이 같은 암, neurodegeneration, 그리고 신진 대사 장애의 다양한 유형으로 다양한 인간 질환과 관련된 있습니다. 대상 단백질의 변경 또는 정상 ubiquitination의 감지는 이러한 질병의 pathogenesis에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜 설명

프로토콜

교양 세포에서 단백질의 ubiquitination 검색

1. 관심 단백질과 (에피토프 - 태그의 버전) ubiquitin을 표현 plasmids와 Transfect 교양 세포.
2. 전체 세포 용해 완충액 (2 % SDS, 150 MM NaCl, 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0) 2mM 나트륨 orthovanadate, 50 MM 나트륨 불화, 그리고 프로 테아제 억제제와 함께.하십시오
3. 접시 당 100 μl 세포 용해 완충액 (6cm 요리)와 세포를 Lyse. 큰 접시를 사용하는 경우, 적절하게 볼륨을 조절할 수 있습니다. 소용돌이는 음식을 신중하게 용해 버퍼가 성장 세포의 전체 영역을 커버하도록.
4. 휴대 스크레이퍼로 세포를 수집하고 1.5 ML eppendorf 튜브에 세포 lysates를 전송할 수 있습니다. 10 분 끓인 즉시 뜨거운 접시에 튜브를 놓습니다.
5. sonication 장치와 전단은 세포.
6. 희석 버퍼의 900ul (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 150 MM NaCl, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 %의 트리톤) 추가합니다. 회전 30-60 분 4 ° C에서 샘플을 품어.
7. 30 분 20,000 XG에서 희석 샘....

토론

이 프레 젠 테이션에서, 우리가 처음 교양 포유 동물 세포에 대한 관심의 단백질에 ubiquitin 수정을 감지 허가 단계를 설명했다. 하지 않은 covalently 상호 작용하는 단백질에 대한 관심의 단백질에 특별히 ubiquitination를 감지하기 위해, 우리는 세포 용해, immunoprecipitation과 ^{1,3 세척을위한} 엄격한 조건을 사용합니다. 안티 ubiquitin immunoblotting 다음과 같은 거친 상태로 표적 단백질의 immunoprecipitation 감지 Ubiquitination은, 따라서 대상 단백질에 구체적으로 가능성이 높습니다. 실험 절차 중에 단백질 deubiquitination을 방지하기 위해, 같은 N - ethylmaleimide과 ubiquitin 알데히드와 같은 deubiquitinating 효소 억제제는 모든 버퍼 ⁴ 추가할 수 있습니다. 그러나, 그것은 deubiquitination 효소는 10 분 끓는 절차 후에 .......