형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

요약

의 선택, microinjection, 그리고 영상은 형광을 통해 F - 굴지 찬란 - 라벨 (FSM) 현미경을 작은 반점을 찍다.

초록

이 프로토콜에서는 형광등의 사용이 PtK1 셀에 굴지 역학 고해상도 이미지를 캡처하는 현미경 (FSM)을 스페클 설명합니다. FSM의 독특한 장점은 살아있는 세포 내에서 F - 굴지 네트워크의 움직임과 매출의 속도론 (조립 / 해체)을 캡처하는 능력입니다. 이 기술은 컴퓨터 비전 소프트웨어 (qFSM)와 결합하여 F - 굴지 역학의 양적 측정을 파생에 특히 유용합니다. 우리는 선택, microinjection 및 생활 세포에 형광 프로브 굴지의 시각화를 설명합니다. 중요한 것은, 유사한 절차는 다른 macomolecular 어셈블리를 시각화하기 위해 적용됩니다. FSM은 microtubules, 중급 필라멘트 및 부착 단지에 대한 증명되었습니다.

프로토콜

섹션 1 : FSM에 대한 찬란 분류 굴지 구하기

자료가 필요합니다 : 굴지, 형광단을 (알렉사, X - rhodamine 권장) 정화. G - 버퍼, 초원 심 분리기

1. 좋은 FSM 영화를 인수하는 핵심 구성 요소는 선택의 형광단과 굴지의 적절한 라벨링 (또는 다른 cytoskeletal 단백질)이 필요합니다.
   우리는 알렉사의 fluorophores (488, 568 파장)와 굴지의 표면에 리신 잔류물을 노출 대상 X - rhodamine succinimidyl 에스테르 유도체를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 귀하의 형광단과 적절한 파장을 선택하면 형광 태그를 수용하기 위해 (수은 아크 램프 및 / 또는 레이저)하여 현미경 설치 프로그램이 적절한 필터 (여기 및 방출)과 illuminators을 가지고 있는지 확인합니다. 우리는 자동 형광 및 사진 손상의 영향을 최소화하고, GFP - conjugates와의 호환성을 보장하기 위해 빨간색 파장 (560-630 nm의)에 주황색의 파장을 선택하는 것이 좋습니다.
3. 순수의 굴지는 쥐 또는 치킨에 속하는 근육 조직에서 추출한지만, 근육 아세톤 분말에서 장기 적출 수술을 필요로하실 수 있습니다. 근육 아세톤 가루는 Invitrogen에서 ....

토론

성공적으로 이미지를 작은 반점 얻기위한 몇 가지 주요 요소가 중요한, 그러나 좋은 speckles 시작하고 찬란 레이블 굴지의 품질과 끝. 레이블이 붙은 단백질 자체가 용해 및 집계 무료되어야하는 동안 0.7-0.4 주위 설정 굴지 단량체에 염료의 높은 상표 비율은 speckles가 밝고 개별 나타납니다되도록합니다. 마찬가지로 중요한 microinjection 절차입니다. (과 생존) 정상 세포 항상성을 보장하기 위해, 전지 라벨 단백질의 낮은 농도를 소개 낮은 흐름의 압력으로 주입해야합니다. 이것은 microinjection 시스템의 사용에 관한 전문 지식 / 경험이 어느 정도 필요합니다. 일반적으로, 짧은 주사 시간 (<1S) 이상 사출 회 이상 선호하고 있습니다. 마지막으로 중요한 구성 요소는 현미경입니다. 대부분의 핵심 시설에있는 수은 램프 에피 조명기,와 결합하여 거꾸로 현미경, 영상을 작은 반점을위한 적절한 플랫폼으로 될 것입니다. 높은 NA의 객관적이고 냉각 CCD 카메라의 조합이 밝은 speckles의 고해.......

재료

사출 버퍼 (IB)
50 MM 칼륨의 글루 탐 산염
0.5 M MgCl2 (부록 2A)
-20 ° C에서 2 년 최대 쇼핑몰

 

G - 버퍼
이 MM 트리스 ⋅ Club 호텔, 산도 8.0 (부록 2A)
0.2 MM CaCl2 (부록 2A)
바로 사용하기 전에 추가 :
0.2 MM ATP (100 MM을위한 요리법을 참조)
2 - 메르 캅 토 에탄올 0.5 MM

4 일일까지 저장 ° C