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도설 forebrain의 explants에 대한 성장 인자 - 코팅 비드 배정

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

이 동영상은 개발 대뇌 피질의 explants에 성장 인자와 함께 코팅했습니다 구슬을 준비하고 삽입을위한 두 가지 방법을 보여줍니다. 이 구슬은 forebrain의 explants 같은 신경 조직을 개발 공간 제한 유전자 발현을 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 방법은 Affi - 젤 구슬과 헤파린 acryllic 구슬을 모두 사용 주어집니다.

도설 Forebrain의 Explants에 대한 성장 인자 - 코팅 비드 배정

이것들이 제가 사용할 첫 번째 유형의 비드입니다. 바로 젤 블루 젤 비드이며, 질감이 부드럽습니다.따라서 이 비드들을 X 위에 배치하기 위해 마우스 피펫 끝에 풀드 글라스 피펫을 연결하여 사용해야 합니다. 두 번째로 시연할 비드는 헤파린 아크릴 비드입니다. 이것들은 단단한 유형의 비드이며, 텅스텐 바늘을 사용하여 이 비드들을 X 외식물 위에 배치하겠습니다. 여기 있는 것들은 분젠 버너를 사용하여 먼저 녹일 글라스 모세관 튜브들입니다.그다음, 더 미세한 팁을 만들기 위해 관을 당겨줍니다. 모세관을 불꽃 중앙에 두고 관이 녹을 때 천천히 회전시킵니다. 이때 관이 부드러워지는 것이 느껴집니다.불꽃에서 꺼낸 다음 잡아당기겠습니다. 다이아몬드 팁 펜으로 모세관에 선을 그어 깨끗하고 직선으로 절단될 수 있도록 하겠습니다. 그 후 끝부분을 화염 연마하여 정리하겠습니다.모세관 끝을 다듬고 입구를 좁게 만들어, 비드가 모세관을 그냥 통과하지 않고 포집될 수 있도록 불꽃에 통과시키겠습니다. 주의할 점은 모세관을 불꽃 속에 너무 오래 두어서는 안 된다는 것입니다. 매우 빠르게 통과시켜야 하며, 그렇지 않으면 입구가 밀봉되어 버립니다.화염에 의해 팁 끝부분이 밀봉되는 경우가 많기 때문에 보통 여러 개를 만들어 둡니다. 이를 조절하기가 어렵기 때문에 여러 개를 제작하는 것이 좋습니다. 이것은 팁 끝부분이 밀봉된 사례입니다.이것은 성능이 좋은 피펫의 예시입니다. 이 에펜도르프 튜브에 아가로스 비드 250 µL를 분주했으며, 비드가 담겨 있던 azi 용액을 제거하기 위해 1 mL의 PBS로 5회 세척하겠습니다. 비드가 가라앉을 때까지 약 3분 동안 기다린 후, 과량의 PBS를 흡입하여 제거하고 이 과정을 4회 더 반복하겠습니다.비드가 아직 완전히 가라앉지 않았습니다. 비드가 가라앉으면 과량의 PBS를 흡입하여 제거하고 이 과정을 4회 반복하겠습니다. 마지막으로 300 µL의 PBS를 추가하여 비드 작업을 시작하겠습니다. 이것은 표준 마우스 피펫이며, 제가 뽑아낸 모세관을 피펫의 약 3분의 1 높이까지 밀어 넣겠습니다.먼저, 피펫을 PBS로 채웁니다. 일반적으로 모세관 현상만으로도 충분히 채워집니다. 여기 30mm 배양 접시의 뚜껑이 있으며, 그 위에 파란색 비드 한 방울을 떨어뜨려 놓았습니다.그 옆에는 PBS 한 방울이 있습니다. 그리고 여기 디쉬에는 5 µL의 단백질 용액 방울이 있습니다. 이 경우에는 BN P4를 사용했지만, 마이크로 파이펫을 사용하여 원하는 단백질을 사용할 수 있습니다.여기 파란색 원 안에 있는 비드를 옮겨 PBS 액적(droplet)에서 한 번 헹궈내겠습니다. 그다음 마우스 피펫으로 비드를 집어 단백질 용액 액적에 넣고, 실온에서 약 1시간 동안 또는 4°C에서 수 시간 동안 배양하겠습니다. 여기 보시면 PBS 내에 비드들이 모여 있는데, 여기서 적절한 크기의 비드를 선택해야 합니다.비즈의 크기가 너무 작으면 입 파이펫을 통해 그대로 빠져나갑니다. 비즈가 끝부분에 그대로 걸려 있어야 합니다. 이제 제가 거기서 큰 비즈 3개와 작은 비즈 3개, 총 몇 개의 비즈를 선택한 것을 보실 수 있습니다.실험에 더 큰 비드를 사용하겠습니다. 이제 PBS 액적에 있는 큰 비드를 단백질 용액 액적으로 옮기겠습니다. 이를 위해 마우스 피펫에서 혀를 조심스럽게 뗍니다.빨아들이는 동작이 아니라, 약간의 음압을 가하는 것입니다. 그런 다음 이를 옮겨서 혀를 다시 입구 쪽에 놓습니다. 파이프 헤드 부분에서 바람을 불어넣는 것이 아니라, 단순히 양압을 가해 비드를 끝부분에서 밀어내는 것입니다.이제 단백질 용액 방울 내에 5개의 비드가 포함되었습니다. 이를 4°C에서 수 시간 동안, 또는 대안적으로 실온에서 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 이것은 배지 위에 떠 있는 막과 이미 해부한 가지-세포(eggplants)가 들어 있는 배양 접시입니다. 피펫 팁을 사용하여 배지를 일부 흡입하겠습니다.비드를 X 평면에 놓기 직전에 배지 한 방울로 한 번만 헹궈내겠습니다. 이것들은 아크릴 비드를 집어 옮기는 데 사용할 텅스텐 바늘입니다. 이것이 텅스텐 바늘이며, 현재 홀더에 고정되어 있습니다.그리고 이것은 정밀 핀셋입니다. 45도 각도로 되어 있습니다. 텅스텐 바늘 핀셋을 사용하여 PBS pool에서 비드를 들어 올려 단백질 용액 방울로 옮기겠습니다.아가로스 비드(agel beads) 때와 마찬가지로, 이 아크릴 비드들도 PBS로 5회 세척한 후 한 방울을 이 플레이트로 옮겼습니다. 이제 포셉으로 텅스텐 바늘을 이용해 비드를 단백질 방울로 옮기고, 젤 비드 때와 동일하게 배양하겠습니다.이제 비드를 들어 올리겠습니다. 오른손을 테이블에 단단히 고정하고, 왼손 검지로 바늘을 안정시키며 액체 속으로 내려갑니다. 바늘로 비드를 가볍게 건드려 천천히 액체 밖으로 들어 올립니다. 때때로 비드가 바늘에서 떨어질 수 있으므로, 그럴 때는 다시 시도하여 다른 비드를 잡으십시오.이제 왼손으로 45도 각도 포셉을 잡습니다. 포셉 끝을 아래로 향하게 하여 비드와 니들을 액체에 접촉시킨 후, 포셉 끝을 이용해 조심스럽게 밀어내어 제거합니다.이제 단백질 내에 5개의 비드가 있습니다. 좋습니다. 이제 오른손으로 텅스텐 바늘을 비드에 꽂고, 왼손으로는 다시 포셉을 사용하여 앞서 4개를 밀어냈던 것과 동일하게 끝부분을 아래로 향하게 합니다. 이 과정을 다시 한번 설명하겠습니다. 37°C에서 배양하며, 시간은 특정 분석법에 따라 달라집니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

University of California, Irvine (UCI).  이 동영상은 개발 대뇌 피질의 explants에 성장 인자와 함께 코팅했습니다 구슬을 준비하고 삽입을위한 두 가지 방법을 보여줍니다. 이 구슬은 forebrain의 explants 같은 신경 조직을 개발 공간 제한 유전자 발현을 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 방법은 Affi - 젤 구슬과 헤파린 acryllic 구슬을 모두 사용 주어집니다.

도설 Forebrain의 Explants에 대한 성장 인자 - 코팅 비드 배정

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