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방법 논문

수확 및 준비 Drosophila 태아

12.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/1347

⸱

2009년 5월 20일

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

이 논문에서

요약

이 기술은 immunohistochemistry 또는 electrophysiological 레코딩을위한 Drosophila 배아의 neuromusculature를 제공​​합니다. 그것은 신경근육학 개발 초기에 이벤트를 공부하거나 부화 수없는 돌연변이의 전기 생리학을 수행하는 데 유용합니다.

초록

Drosophila는 배아 발달과 기능 모두의 신경 과학 연구를위한 최고의 유전자 모델입니다. 전통적으로,이 필드는 주로 독립적인 역사 및 과학 사회와 서로 꽤을 분리하고 있습니다. 그러나 이러한 일반적으로 서로 다른 분야 사이의 인터페이스는 기능 전기적 신호 특성과 신경 회로 형성의 마지막 단계에서 기능성 화학 시냅스의 분화 취득을 기본 발달 프로그램입니다. 이 인터페이스는 조사를위한 중요한 지역입니다. Drosophila에서 기능의 개발이 단계는 embryogenesis의 마지막 세번째 동안 <8시간 기간 (25 ° C에서)하는 동안 발생합니다. 이렇게 늦게 발달 기간 동안 힘든, 스며들지 표피 표피의 증착에 수사 때문에하는 어려운 여겨졌다. 획기적인 사전은 로컬 말기 태아의 제어 절개를 사용하는 표피에 적용할 수있는 물 polymerizing 수술 접착제의 적용되었다. 지느러미 세로 절개로 배아가 실험 조사하기 위해 복부 신경 코드 및 신체 벽면 근육을 노출, 평면 마련하실 수 있습니다. 이 제도는 크게 배아 버렸네 형성에 악영향을하고, 따라서 버렸네 연결과 기능 시냅스 신호 속성의 사양과 차별을 규제하는 분자 메커니즘을 밝혀 유전자 돌연변이를 분리하고 특성화하는 데 사용되었습니다.

프로토콜

1 부 : 장비 및 소모품

  1. 좋은 해부 현미경은 배아 해부가 필요합니다, 40X 배율은 maximally 배율을 증가 25X 눈길을 조각으로 제안합니다.
  2. 좋은 포셉 (숫자 5) 배아와 태아의 devitellinization의 수동 선택이 필요합니다.
  3. 미세 유리 바늘을 만들고 수정할 수있는 장비가 필요합니다. 아이고 - 유리 바늘은 절개가 필요합니다. 우리는 해부 (오래)에 대한 단단한 유리를 선호하지만, 표준 두꺼운 벽의 유리 튜브 (외경 1-1.5 mm)가 잘 작동합니다. 어떤 사람들은 10 + 앰프 autotransformer 배터리를 사용하여 1M NaOH의 목욕탕에서 원하는 선명도에 electrolyzed 미세 텅스텐 바늘을 사용합니다. 날카롭게 텅스텐 절개의 바늘들은 비교적 탄력과 오래 지속되는 장점이 있습니다. 중공 유리 바늘은 (클램프 전극 패치와 유사한 구성) 플라스틱 튜브에 연결된과 호수의 흡입 및 퇴학에 대한 해부뿐만 아니라 접착제의 통제 배달하는 동안 사용됩니다. 유리 pullers의 다양한 유리 바늘 제조에 사용할 수 있습니다. 컴퓨터 프로그램 pullers는 모양과 크기의 다양한 잡아 미리 수 있습니다. 브라운 - 플라밍 모델 것은 (서터 악기 주식 회사) 널리 선호하고 있습니다. 복합 현미경 (20 - 40X 목표)을 사용하기 전에 점검하고 전극을 수정할 수 있어야합니다.
  4. 솔루션의 두 가지 유형은 일반적으로 목욕 해부 동안 배아 조직을 위해 사용됩니다 : 1) "표준"(1 월 및 월, 1976a) 또는 "수정된 표준"(Broadie, 2000) 살린스, 일반적으로 다른 무척추 동물 시스템에서 레코딩에 사용되는 솔루션을 기반으로 , 2) "haemolymph처럼"(HL) 살린스 (스튜어트 외 1994), 표준 호수와 Drosophila의 haemolymph에서 측정한 이온 농도 사이의 타협. 그것은 이러한 살린스 중 아무도 정확하게 생체내에 haemolymph의 화학 성분 (Broadie, 2000)을 모방하지 않습니다 언급해야합니다. 표준 생리가 포함되어 있습니다 (MM)을 : 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 72 자당, 5 TES, 산도 7.2. 경험은 또한 electrophysiological 녹음에 적합하지만, 노출 조직의 건강을 보호하기 위해 가장 가능성이 상업적으로 준비 곤충 생리 (예 : 슈나이더의 곤충 미디어)을 고려할 수 있습니다.

2 부 : 엠브료 스테이징 및 해부

  1. 최적의 달걀 수집, 젊은 (<7 일), 건강한 남성 후 2-3 일 동안 신선한 누워있는 냄비에 여성 파리 (20-40) 유지합니다. 부설 냄비는 일반적으로 60mm의 한천 플레이트를 다루는 적절한 공기 순환을 제공하기 위해 천공 100 ML 플라스틱 비커 (트라이 붓고)로 이루어져 있습니다. 한천 플레이트 애플이나 한천과 함께 강화된 포도 주스가 포함되어 있습니다. 몇 가지 요리법이 존재하지만, 다음과 같은 일례는 다음과 같습니다 물 700 ML, 25~30g의 한천, 주스 집중 (포도 혹은 사과), 0.5g 메틸 paraben (P - hydroxymethylbenzoate) 300 ML, 그리고 30g의 설탕을. 물과 한천을 압력솥, 별도로 설탕, 주스와 P - hydroxymethylbenzoate을 끓여. 한천과 주스 솔루션을 믹스하고 신속하게 거품을 제거, 60mm 접시에 부어.
  2. 이전 계란 컬렉션, 파리는 적어도 이틀 동안 적어도 하루에 두 번 변경 신선한 접시에 효모 붙여넣기 (4 ° C에 저장된 물을 9 ML에 7g 베이커의 효모)와 함께 공급됩니다. 일 3, 좋은 냄비는 시간당 100-200 계란을 생산해야합니다. 더 나은 계란 누워은 긁힌 접시의 한천과의 측면에 유지 냄비에 관찰됩니다. 많은 배아가에 누워 또는 흠집 옆에 것입니다.
  3. 배아 많은 수의를 수집, 부드럽게 페인트를 사용하여 바구니에 한천 플레이트에서 배아를 전송합니다. 바구니는 15 또는 50 ML의 원심 분리기 튜브로 만들 수 있습니다. 뚜껑과 튜브의 상단 사이에 화면 (70 μm의 메쉬)를 함정에 충분한 면적을두고 아래를 잘라. DH 2 0으로 배아를 씻어 외부 chorion를 제거하는 신선한 50 % 백퍼센트 표백제의 페트리 접시에 넣어. 또는, 계란은 잘 집게를 사용하여 개별적으로 수집하고, 표백제의 드롭에 수동으로 배치하여 dechorionated 수 있습니다. 데 - chorionation 30 초에서 2 분 (신선한 표백제가 훨씬 빨라집니다)에 걸릴 수 있고, 해부 현미경 아래에서 모니터링해야합니다. chorion의 제거는 반짝 이는 투명 vitelline 막을 제공합니다. 표백 빠르게 devitellinized 조직을 파괴 등 Dechorionated 계란은 간략하게, 씻어서, 또는 호수에 배치해야합니다.
  4. 그것은 신중하게 원하는 발달 시대에 배아 단계에 중요합니다. 정의된 Drosophila 배아의 단계 (1-17, 캄포스 - 오르테가와 Hartenstein, 1985) 모든 기능 신경근육학 개발이 늦은 단계 16 단계 17 발생으로 유용하지 않습니다. 따라서 배아가 25 개발 시간에서 개최 아르 ° C를 humidified 배양기에서 수정 이후에 시간 더 일반적으로, 달걀 누워 (AEL) 이후. 이러한 조건에서 embryogenesis 21 정도 + / - 25 ° C. 1 시간
  5. 초과 달걀하다 (계란에서 1-2 시간적절하게 세 아르들)은 다음 형태학의 기준 볼 수 있습니다. DH 2 O의 광범위한 세척 후 dechorionated 계란이 볼 수있는 플라스틱 문화 요리 (DH 2 O 미만)에 배치됩니다. 정확한 스테이징은 해부 현미경 (캄포스 - 오르테가와 Hartenstein, 1985)로 반사광을 사용하여 형태학의 기준으로 확인하실 수 있습니다. 부화 직전의 성숙 말기 태아 (22 - 24 AEL)은 일반적으로 표피와 부풀기도의 세분화에 의해 인정됩니다. 배아는 GFP balancers하고 적절한 필터와 형광 해부 현미경을 사용하여 genotyped 수 있습니다.
  6. 해부 들어, dechorionated 및 발달 개최 배아는 호수의 드롭 (단계 1.5 참조) 아래 coverslip에 (최대 지느러미 쪽) 첨부합니다. 배아는 유리 micropipette 또는 텅스텐 바늘 앞쪽에 또는 사후 끝 부분에서 막을 펑쳐링 다음 부드럽게 멤브레인에서 배아를 자유롭게하여 vitelline 막에서 제거됩니다. 해부 준비에서 배아는 등의 표면 접속 (절개는 복부 신경 시스템과 실험 neuromusculature를 노출합니다 최대 도설 면을 coverslip에 위치해야합니다. 단, 배 (胚)가 분명 다른 접근을 촉진하기위한 다른 방법으로 위치 수 티슈.)
  7. 초기 단계의 배아 (<16 시간 AEL)은 유리 또는 polylysine (; Broadie 및 베이트, 1993a, B 폴리 - L - 라이신의 브롬화 수 소산​​)와 코팅 유리를 청소에 직접 연결합니다. 표피 형성 이전 다음 배아는 (> 16 시간 AEL), 이상적으로 Sylgard - 코팅 (다우 코닝) coverslips에게 붙어 있어야합니다. 수상 polymerizing cyanoacrylate 수술이나 동물 접착제는 (Broadie와 베이트, 1993c, D)이 사용됩니다. 접착제는 입을 압력에 의해 제어되는 접착제의 흐름과 고무 튜브에 연결된 작은 유리 전극 피펫 (10-20 마이크로 미터 내경 팁)를 통해 전달됩니다. 접착제가 호수에 연락시 신속하게 polymerizes으로 케어는 접착제 배달하는 동안 이동해야합니다. 접착제가 이가의 이온은 중합 있어야으로 gluing가, 아니하거나 낮은 이가의 이온 농도와 호수에서 수행할 수 없습니다 또한 있습니다. 접착제 소량 먼저 단단히 머리와 꼬리를 첨부하는 데 사용됩니다.
  8. 배아의 끝부분이 coverslip에 붙어되면, 절개는 유리 전극 또는 날카롭게 텅스텐 바늘 등의 정중선을 따라 이루어집니다. 이것은 부드럽게 최종 상처를 만들기 전에 절개의 선을 perforating로 쉽게 이루어집니다. 절개의 측면은 다음 부드럽게 배아 평면을 확산하기 위해 더 많은 접착제로 coverslip에 붙어 있습니다. 직감, 지방 기관과, 선택, 기관은 다음 고무 튜브 (Broadie 및 베이트 1993a - C)에 부착된 유리 피펫을 사용하여 흡입하여 제거를 포함한 내부 장기. 배아 이제 복부 중추 신경계와 표피 아래, 주변 신경, coverslip에 평평 첨부하고, 체세포 근육이 실험에 대해 노출되어야합니다.

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토론

배아의 정확한 준비로 인해 단지 몇 시간의 시간 코스 이상의 기능 속성의 급속한 성숙에 중요합니다. 몇 가지 문제는이 준비를 복잡하게. 첫째, 대부분의 연구자들은 초과 계란 단계 배아에 들이죠를 사용하지만, 계란 누워있는 시간이 서로 다른 조건 (Broadie 외. 1992)의 동물에서 동물로 매우 다를 수 있습니다. 특히, 제한된 다이어트 여성 전에 누워로 연장 기간 동안 수정된 달걀을 유지하는 경향이 있습니다. 그것은 이전에 적어도 2 일간 풍부한 효모 다이어트 수유 계란 (Broadie 외. 1992) 수집에 의해 '삭제'암컷하는 것이 중요합니다. 또한, 세 여자는 이전에 누워하는 이상 기간 동안 달걀을 유지합니다. 오래된 여성은 정기적으로 사전에 자신의 부화에만 달걀 몇 시간을 누워 수 있습니다. 그것은 가장 일관된 누워 회 (Broadie 외. 1992)에 대한 젊은 여성을 (<7 일간)을 사용하는 것이 중요합니다. 둘째, 늦은 배아 단계 동안, 그것은 전적으로 형태학의 기준에 의해 배아를 무대하기...

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감사의 글

킬로바이트는 NIH 부여 GM54544에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
배아 수집 케이지Genesee Scientific59-100 (60 mm 디쉬용; 다른 사이즈 가능)케이지는 비디오에 표시된 것처럼 구멍을 뚫은 3중 포어 비커를 사용하여 직접 제작할 수도 있음
Sylgard 184Dow Corning다양한 회사에서 구입 가능수술용 접착제는 sylgard 코팅된 커버슬립에 더 잘 부착됨
미세 유리관, 외경 1.0-1.5 mm다양함해부를 위한 미세 유리 바늘 및 접착제 도포용 튜브 제작용
플라스틱 튜브, 입 흡입 및 접착제 도포를 위해 유리 피펫에 연결함Tygon튜브 내경이 유리의 외경과 일치해야 함.

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