방법 논문

체외에서 피부 자극 시험 (SIT)는 인간 표피 (RHE) 모델 재구성

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DOI:

10.3791/1366

⸱

2009년 7월 13일

 ,  ,  ,  , 
1MatTek Corporation

이 논문에서

요약

이 비디오에서는, 우리는 EpiDerm의 피부 자극 시험 (EpiDerm SIT) 개발에 대한 검증을 보여주 체외에서 피부 자극 테스트.

초록

EpiDerm의 피부 자극 시험 (EpiDerm SIT)이 개발되었습니다

프로토콜

I. 조직 헤어드라 이어 - 주 영

  1. EpiDerm 에피 - 200 - SIT 키트 수령시, 무결성에 대한 모든 키트 구성 요소 (키트 자세한 내용은 특정 시약 및 장비의 표 참조) 확인하십시오.
  2. 모든 세 EpiDerm 조직 들어, 하나의 무균 6 웰 플레이트 분석 매체의 0.9 ML로 미리 채워진을 준비합니다.
  3. 무균 조건에서 EpiDerm 조직을 포함하는 24 잘 플레이트가 들어있는 비닐 봉투를 열고 멸균 거즈를 제거합니다.
  4. EpiDerm 조직을 포함하는 각각의 삽입을 제거하고 빈 24 잘 플레이트에 삽입을 배치 살균 집게를 사용하십시오. 이 단계 동안, 살균 필터 종이에 모래 바닥 부드러운하여 삽입의 바깥 양쪽에 부합하는 나머지 운송 아가로 오스를 제거합니다.
  5. 다음 5 분 이내, 시각적으로 조직을 검사. 완전히 액체로 덮여 결함이 조직이나 조직을 사용하지 마십시오.
  6. 멸균 면봉 팁 면봉을 사용하여 조심스럽게 조직의 표면을 건조. 직접 조직을 만지지 마 - 모세관 효과는 조직 표면에서 수분을 제거하기에 충분합니다.
  7. 조직 표면을 건조 후 6 웰 플레이트 분석 매체의 0.9 ML로 미리 채워진 맨 윗줄 세 조직을 전송하기만하면됩니다. 삽입 아래에 갇혀있는 공기 방울을 릴리스합니다.
  8. 60 인큐베이터에 삽입을 포함하는 6 자 번호판을 플레이스 ± 37 5 분 사전 부화 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH (상대 습도).
  9. 60 ± 5 분 사전 잠복기의 끝에, 6 잘 판의 아래쪽 우물에 상단 우물에서 삽입을 전송. 인큐베이터에 다시 접시를 놓고 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH) 사전 부화 (18 ± 3 시간) 하루를 위해.
  10. 냉장고 (5 ± 3 ° C).로 분석 매체의 나머지 플레이스 사전 부화 하룻밤에 따라 테스트 화학 물질은 EpiDerm 조직에 적용할 수 있습니다.

    참고 : 사전에 부화 절차 (조직 화요일 대신에 수요일에 도착하는 경우 예) 늦은 조직 배달의 경우 단축하실 수 있습니다.

II. 화학 노출 - 1 일

  1. 전용 0.9 ML로 당 잘 분석 매체의 상단을 작성하여 테스트 화학 당 하나의 6 - 플레이트 잘 준비.
  2. 약 5 분 화학 물질에 노출되기 전에 계획, 인큐베이터에서 미리 에어컨 조직을 포함하는 6 자 번호판을 제거합니다.
  3. 조직의 표면을 평가하고 소독면 도움말을 사용하는 수분을 제거합니다.
  4. 시험 재료 코드 또는 이름을 가진 모든 6 - 웰 플레이트 뚜껑을 라벨.
  5. 선량 일분 간격으로 테스트 화학 물질과 조직이 노출 후 테스트 화학 물질 rinsing 촉진합니다. 마지막으로 조직이 약을 복용 때까지 멸균 후드에 복용 조직과 접시 보관하십시오.
  6. 액체 화학 물질을 테스트하려면 직접 조직 위에 솔루션을 30 μL를 분배하여 조직 표면에 나일론 메쉬를 놓습니다. 필요한 경우, 부드럽게 유리 파스퇴르 피펫으로 향하고 전구를 사용하여 메쉬의 위치. 조직 표면에 누르지 마십시오.
  7. 테스트 semisolids 경우, 직접 조직 위에 30 μL 하는걸 긍정적인 변위 피펫을 사용합니다. 필요한 확산 파스퇴르 피펫으로 화학 물질이 조직 표면에 최대한. 가리면
  8. 고체 재료, 곧 시험 물질의 응용 프로그램을하기 전에 멸균 DPBS 25 μL로 조직 표면을 축축하게하다. 이것은 테스트 화학 물질로 조직 표면의 접촉을 향상시킬 것입니다. 잘게 지상 시험 물질의 약 25 MG와 25 MG 보정 날카로운 응용 프로그램 숟가락을 (또는 다른 적절한 도구를) 입력합니다. 조직 표면에 고체 테스트 화학을 적용합니다. 필요한 경우, 완전히 숟가락을 비우 파스퇴르 피펫으로 향하고 전구를 사용합니다. 부드럽게 표면에 고체의 확산을 개선하기 위해 삽입을 흔들.
  9. 밀랍 일관성과 시험 물질의 경우, 직경 8mm에 대한 조각 평면 "같은 쿠키"를 형성하고 이전 살균 DPBS로 침수 있던 조직, 위에 그것을 배치하십시오. 시험 물질과 조직 사이의 연락을 개선하기 위해서, 스테인리스 스틸 또는 플라스틱 구호로 "쿠키"를 누르다.
  10. 부정적인 제어 및 관리 조직에 대한 긍정적인 제어로 5% SDS와 같은 DPBS을 적용합니다.
  11. 마지막으로 조직을 먹이지 후, humidified 인큐베이터 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH). 35에 대한 모든 접시 ± 1 분 전송
  12. 35 후 37 ± 1 분 보육 ° C 배양기에서 모든 접시를 제거하십시오. 멸균 후드에 접시를 놓고 60 분 화학 노출의 기간이 가장 먼저 약을 복용 조직에 대한 완료될 때까지 기다립니다.
  13. 후 (insur하는 분 시간 간격마다 하나 삽입을 사용하여 세척 절차를 시작모든 삽입에 대한 총 노출 시간이) 60 분입니다 전자.
  14. 무균 DPBS과 조직을 씻어 수있는 세척​​ 병을 사용합니다. DPBS의 지속적인 흐름을 이용하여 15 배 삽입 조직을 입력하고 (참고 그것을 빈 :. 나일론 메쉬와 조직을 위해, 조직의 표면, 5 번 세척하고 지적, 날카로운 집게와 함께 신중하게 메쉬를 제거 후, ​​나머지를 계속 10 씻는다).
  15. 15 150 ML의 DPBS 완전히 잠수함, 삽입 3 번 씻어 병을 사용하여 씻어 시험 자료의 나머지 부분을 제거 흔들 후.
  16. 마지막으로, 내부로부터 한번 조직 삽입을 씻어 한번 살균 DPBS와 함께 밖에서.
  17. 부드럽게 삽입을 흔들림과 멸균 압지에 모래 바닥하여 조직에서 DPBS의 초과를 제거합니다.
  18. 이전에 분석 매체로 미리 채워진 새로운 6 - 잘 판에 blotted 조직 삽입을 전송합니다. 다음 단계의 모든 (14-18)는 각각의 삽입을위한 1 분 이내에 이루어져야합니다.
  19. 마지막으로 조직 씻어서 후 멸균 면봉 각 조직의 표면을 조심스럽게 건조 면봉 스쳐.
  20. 24 ± 2 시간 동안 인큐베이터에서 조직을 품어 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH).

    참고 : 각 분석 기술자는 아래 설명된대로 프로토콜을 따라 수 있도록, 단일 테스트 실행 (세트)의 부정과 긍정적인 컨트롤을 포함하여 6 개 이상의 시험 물질을 시험하지 말아야

III. 중간 교류 - 주 2

  1. 24 후 ± 이시간 이후 부화는 6 자 판, 미디어 0.9 ML로 미리 채워진 하단 부분에 삽입을 전송하기만하면됩니다. 상단 행에서 미디어는 추가 끝점 (크린 시토킨, chemokines 등)의 분석을 위해 수집하실 수 있습니다. 보조 종점의 분석은 선택 사항입니다.
  2. 이후 부화를 계속 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH) 또 다른 18 ± 3 시간.

IV. MTT의 생존 분석 - 3 일

  1. 화학 이름이나 코드와 함께 레이블이 24 잘 접시. 하나의 플레이트는 MTT와 조직 배양을 위해 봉사하고 추출 단계에 대한 다른 것입니다.
  2. MTT 집중 (5 MG / ML)를 해동 및 MTT의 희석제로 diluting하여 MTT 솔루션을 준비합니다. MTT 용액의 최종 농도는 1 MG / ML입니다.
  3. 24 잘 판의 각 우물에 MTT 용액 피펫 300 μL.
  4. 인큐베이터에서 6 자 번호판을 제거 압지에 삽입의 바닥 얼룩하고, MTT 사전 채워진 24 잘 판에 그들을 전송합니다.
  5. 인큐베이터에서 24 잘 플레이트 플레이스 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH)와 3 시간 동안 품어 ± 5 분. 엄밀히 3 시간 준수 ± 다른 MTT의 수치 사이의 편차를 피하기 위해 5 분 배양 시간을.
  6. MTT 보육이 완료되면 부드럽게 모든 우물에서 MTT 매체 대기음하는 흡입 펌프를 사용합니다.
  7. 리필 DPBS와 우물과 다시 대기음. 이 rinsing 두 번 더 반복하고 조직은 지난 흡인 후 건조되었는지 확인합니다.
  8. 세척은 새로운 24 잘 판에 삽입을 전송 후. 부드럽게 각 삽입이 ML의 extractant 솔루션 (이소프로판올)를 pipetting하여 삽입 젖어. 수준은 따라서 완전히 조직을 잠수함이 잠수, 삽입의 위쪽 가장자리 극복할 것입니다.
  9. extractant 증발을 억제하기 위해 24 잘 플레이트 (Parafilm 또는 씰링 봉투를 사용하는 예) 인감. 접시 흔드는 (~ 120 RPM)에 부드러운 잡고 실온에서 최소 2 시간 동안 조직에서 MTT의 압축을 풉니다. 떨지 않고 숙박 추출도 사용할 수 있습니다.
  10. 추출 기간이 완료되면, 피어스 주사 바늘이나 전구 파스퇴르 피펫을 페르시와 추출물이 삽입이 수행된하는 잘으로 실행할 수 있도록 함께 삽입합니다.
  11. 구멍 삽입을 취소하고 동질 때까지 깨끗이 아래 세 번에서 솔루션을 피펫.
  12. 각 조직의 경우, 96 - 웰 플랫 바텀 microtiter 접시에 보라색 formazan 솔루션의 두 200 μL aliquots를 전송. 이 비디오 프로토콜을 함께 스프레드 시트에 지정된 고정 플레이트 디자인에 따라 복사본을 전송합니다. 공백 들어, 이소프로판올를 사용합니다.
  13. 참조 필터없이 570 NM (540-580)의 파장을 사용하여 96 - 웰 플레이트 분광 광도계에서 MTT 추출물의 광학 밀도 (OD)를 참조하십시오.
  14. 결과 자동 계산 (그림 1)의 스프레드 시트에 결과를 입력합니다.
  15. MTT 분석에 의해 결정 %의 조직 생존이 대조군에 비해 <50 %면 시험 화학은 '자극'을 (R38 또는 GHS 분류 2) 표시됩니다.

    참고 : MTT는 유독하므로 취급시 보호 장갑을 착용해야합니다. MTT와 정도 보호빛과, MTT 이후 lutions 구분 빛입니다. 그것이 시간이 지남에 따라 저하하기 때문에 준비 후 몇 시간 이내에 MTT 솔루션을 사용합니다.

V. 분석 품질 컨트롤

  • EpiDerm 에피 - 200 - SIT 키트 접수 기준 :

    체외 RHE 모델에서뿐 아니라 검증 프로세스 (8) 중에, 시간이 지남에 따라 일관성있는 고품질의 데이터를 제공해야합니다. 장기 분석 재현성과 성능을 보장하기 위해 권장 지침 "은 성능을위한 각 많은 샘플링 세포 또는 조직의 전체 특성 ... 및 분석 성능의 일관성 보장을 제공하는 컨트롤 및 벤치마킹 화학 물질의 일반적인 사용"(9) 포함 . 아래에 설명된 검정 합격 기준 이외에, EpiDerm 각 생산 많이 (1 % 트리톤 X - 100) 추가 벤치 마크에 대한 화학 물질 제조 업체에서 품질 테스트를 컨트롤입니다. 노출 시간은 트리톤 Triton X - 100이 결정되는 50 % (동부 표준시 - 50)에 조직 생존을 줄이기 위해 필요. EpiDerm 들어, 연간 평균 동부 표준시 - 50 값은 5.9 시간에서 7.5 시간으로 원거리있다. 부정적인 제어 조직에 대한 많은 정보 CV (베이스 라인 생존의 다양성 즉,)로 많은 1996 년부터 매년 7.5 % 이하 평균 있습니다. 위해 각 생산 많이 ET50 값은 1996 (;; 로우어 수용 한도 = 4.8h 상위 수용 한도 = 8.7h 즉, 동부 표준시 - 50 = 6.7 시간)의 설립 역사적인 평균 트리톤 X - 100 ET50의 2 표준 편차 이내에 가을에해야합니다 제조 업체에서 사용하기 위해 공개합니다.

  • 에피 - 200 - SIT 분석 접수 기준 1 : 대조군 :

    MTT - 시험에서 대조군 (NC) 조직 (멸균 DPBS 대우)의 절대 OD이 절차를 운송 및 저장 후 사용 특정 조건 하에서 테스트 실험실에서 얻은 조직 생존의 지표이다. NC 조직의 평균 OD 570이 ≥ 1.0 ≤ 2.5 경우 검정의 합격 기준을 준수합니다.

  • 에피 - 200 - SIT 어세이 접수 기준 2 : 긍정적인 제어

    5 % SDS (H 2 O)을 솔루션은 긍정적인 제어 (PC)로 사용 테스트 화학 물질과 동시에 테스트합니다. PC 각 분석에서 테스트하기 위해 아니지만 하나 이상의 PC가 일 당 테스트가 필요합니다 있다고 동시 의미합니다. 긍정적인 통제의 생존은 역사적 데이터의 95 % 신뢰 구간 내에 있어야합니다. 부정적인 통제 조직의 %가 20 %로 PC의 조직의 평균 생존이 표현하는 경우 분석은 수용 기준을 만족합니다.

  • 에피 - 200 - SIT 분석 접수 기준 3 표준 편차 (SD)

    피부 irritancy 3 단일 조직 결정 평균 생존의 예측 따라서 조직의 다양성은 acceptably 낮은되어야 복제됩니다. 동일 취급 3의 개별 %의 조직 viabilities에서 계산 SD가 <18 %예요 복제하는 경우 분석은 수용 기준을 만족합니다.

대표 결과

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그림 1 6 시험 기사, NC 및 PC ​​컨트롤에 대한 얻은 결과 -. 결과의 계산을위한 자동 스프레드 시트의 일부. NC에 참조 50% 아래 조직 생존을 감소 테스트 화학은 irritants으로 분류됩니다. 테스트는 충분히 멀리 따라서 분석의 견고를 증가 분류 컷 - 오프 (50 % 생존)에서 아르 결과를 제공하기 위해 최적화되어 있습니다.
자료
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토론

이 비디오에서는, 우리는 EpiDerm의 피부 자극 시험 (EpiDerm SIT) 개발 및 미용 및 제약 원료를 포함한 화학 물질의 체외의 피부 자극 시험에 대한 확인을 증명하고있다. 이 방법을 수행할 때, 그것은 프로토콜의 편차가 다른 결과를 일으킬 수 있기 때문에, 무균 조건에서 작동하고 엄격하게 검증 프로토콜을 수행하는 것이 중요합니다. 검정의 일부 수정이 가능하지만, 프로토콜 변경 사항은 저자와 직접 논의해야합니다.

이 방법의 유일한 한계는 MTT의 종점과 시험 물질의 가능한 간섭이다. 직접 MTT을 감소 색의 시험 물질 혹은 (그리고 따라서 세포 mitochondria 탈수소 효소의 활동을 모방)은 MTT 끝점를 방해할 수 있습니다. 그러나 이러한 시험 물질이 계속 (또는)에 조직을 제시하는 경우에만 MTT 검사 (예 : 42시간 시험 물질에 노출된 후) 시험 물질의 충분한 양을 시점에있다면 문제가 있습니다. 이 가능성 이벤트 (True)로 신진 대사 MTT 감소 및 기여 색깔 시험 자료 또는 제공한 분석 표준 작업 절차에 자세히 설명되어있는 절차에 의해 계량 수있는 시험 자료에 의해 (FALSE) 직접 MTT 감소의 경우 MatTek 주식 회사

공개 사항

저자들은 본 논문에서 사용된 시약 및 도구를 생산하는 MatTek 사의 직원입니다.

감사의 글

저자는 수정 EpiDerm SIT (5 멀티 센터 국제 검증 연구에 참여하기 위해 BfR (독일), BASF SE (독일), IIVS 주식 회사 (미국), Zet - LSL (오스트리아)에서 ZEBET에 감사드립니다 ).

참고문헌

  1. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX. 21, 107-114 (2004).
  2. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA. 33, 351-367 (2005).
  3. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication. ATLA. , Forthcoming (2009).
  4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA. 35, 559-601 (2007).
  5. Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).
  6. United Nations. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).
  7. ESAC. Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , ESAC. (2008).
  8. Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers. Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).
  9. Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).

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EpiDerm SITMTTDPBS5 SDSOD

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