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셋째 instar drosophila의 유충에서 imaginal 디스크의 해부

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

이 프로토콜은 3 instar 단계에서 drosophila의 유충에서 imaginal 디스크를 분리에 사용되는 절개 기법을 보여줍니다. 말하는 후 조직을 고정하고 날개, 다리와 눈 디스크를 제거하는 방법은 직접 이후 시각화를위한 현미경 슬라이드에 시연하고 있습니다.

셋째 Instar Drosophila의 유충에서 Imaginal 디스크의 해부

오늘은 3령 초파리 유충에서 성충판(imaginal discs)을 해부하는 방법을 보여드리겠습니다. 3령 유충의 성충판은 다양한 발달 과정 연구에 활용될 수 있습니다. 저희 실험실에서는 이를 통해 세포 자멸사(apoptosis) 과정을 관찰하지만, 다양한 단백질을 발현시켜 연구함으로써 성충판 내에서 순차적으로 일어나는 온갖 종류의 발달 과정을 살펴볼 수 있습니다.이를 위해 몇 가지 매우 중요한 도구들을 사용할 것입니다. 먼저, 접시에서 유충을 꺼낼 때 사용할 피킹 스틱(picking stick)입니다. 다음으로 매우 중요한 도구는 해부용 핀셋으로, 해부를 원활하게 진행하기 위해서는 매우 날카로워야 합니다.그 다음 11번 수술용 칼날을 사용하여 머리에서 디스크를 제거하겠습니다. 그리고 마운팅 매질로 벡터 쉴드(vector shield)를 사용한 슬라이드 위에 디스크를 배치하겠습니다. 우선 3령의 *Drosophila melanogaster* 유충을 수집하겠습니다.여기서는 피킹 스틱을 사용하여 바이알 벽면에서 유충들을 떼어내겠습니다. 스틱 끝에 물기가 약간 있으면 도움이 될 때가 있으며, 그 다음 PBS 한 방울에 옮겨줍니다. 자, 이제 세 번째 단계의 유충들이 준비되었습니다.저는 오른손잡이이므로 피검체의 머리를 제 오른쪽으로 돌리고, 잡아야 할 위치를 안내해 줄 몇 가지 지표를 사용할 것입니다. 첫 번째는 여기와 여기의 기관 주부분입니다. 그리고 머리 쪽으로 올라가면 작은 횡단면이 있습니다.먼저 유충의 머리로부터 몸통의 약 3분의 2 지점을 부드럽게 잡습니다. 그런 다음 오른손으로 가로 지지대 뒤쪽 몇 밀리미터 지점을 잡는데, 이때 유충 너비의 약 절반 정도까지 잡도록 합니다. 이렇게 하면 적절하게 잡은 것이 됩니다.약 절반 정도 진행된 것을 보실 수 있습니다. 이제 오른손으로 조심스럽게 앞으로 잡아당기면 모든 장기가 밖으로 나오는 것이 보입니다. 이제 몸통의 주요 부분은 폐기해도 됩니다.여기에 입틀에 부착된 성충원판을 포함하는 머리 부분이 있습니다. 원판이 눌리지 않도록 입틀 부분을 잡아 PBS 방울 위로 옮기겠습니다. 이제 고정된 유충 머리가 준비되었습니다.모든 과잉 조직을 제거한 후, 이전과 같이 구강 부위를 잡아 고정하거나 핀셋을 사용하여 해부판에 눌러 고정합니다. 이제 구강 부위가 왼쪽에 위치합니다. 여기 우리가 필요로 하지 않는 장(gut)과 타액선이 보입니다.지방체 또는 지방 조직이 일부 보입니다. 특히 지방은 일부 분석 및 염색을 방해할 수 있으므로, 원하지 않는 부분은 계속해서 제거해 줍니다. 이제 깨끗하게 정리된 유충의 머리 부분이 준비되었습니다.이제 몸체에서 분리하여 고정 및 세척하고, 불필요한 조직을 제거한 유충 머리 부분이 준비되었습니다. 또한 C2 tunnel의 항체 염색이나 다른 기능성 염색 등 필요한 처리를 모두 마친 상태입니다. 이제 이를 슬라이드 위에 올려놓았으며, 머리에서 실제 디스크, 즉 구강 부위를 분리해낼 준비가 되었습니다.이제 구강 부위가 여기 왼쪽에 위치해 있습니다. 포셉을 사용하여 슬라이드 위로 가볍게 눌러 고정하겠습니다. 오른손에는 해부 시 더 정밀하게 사용할 수 있는 11번 메스 날을 잡고 있습니다.먼저 중추신경계(CNS)와 시엽을 제거하겠습니다. 여기에 중추신경계가 있고, 두 개의 시엽이 있으며, 그곳에 안테나-눈 원판(eye antenna discs)이 부착되어 있는 것을 볼 수 있습니다. 시엽과 눈 원판 사이에 칼날을 넣고 천천히 당겨서 중추신경계를 제거하면, 눈 원판이 다음과 같이 늘어나게 됩니다.이제 CNS와 시엽이 보입니다. CNS에서 분리된 두 개의 안구 원반(eye discs)이 준비되었습니다. 이제 기저부를 조심스럽게 자르고 당겨서 구강 부위로부터 이를 제거하겠습니다.좋습니다, 한쪽 눈-더듬이 원반과 다른 쪽 눈-더듬이 원반이 있습니다. 그리고 이제 여기서 돌출된 날개 원반을 볼 수 있습니다. 다시 한번 조심스럽게 기부 절단 부위를 찾아 잡아당기겠습니다.여기 날개 discs와 여기에 부착된 다리 disc, 그리고 약간의 기관(trachea)이 보입니다. 네, 다리 disc가 부착된 날개 disc가 있고, 분명 여러 개의 다리 discs가 더 있을 것입니다. 따라서 블레이드로 조심스럽게 탐색하며 더 많은 disc들을 찾아낼 수 있습니다.이 표본에서 찾을 수 있는 디스크는 여기까지입니다. 다리 디스크가 몇 개 더 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

University of California, Irvine (UCI).  이 프로토콜은 3 instar 단계에서 drosophila의 유충에서 imaginal 디스크를 분리에 사용되는 절개 기법을 보여줍니다. 말하는 후 조직을 고정하고 날개, 다리와 눈 디스크를 제거하는 방법은 직접 이후 시각화를위한 현미경 슬라이드에 시연하고 있습니다.

셋째 Instar Drosophila의 유충에서 Imaginal 디스크의 해부

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