Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

Summary

유전자 microarrays는 게놈 전체의 수준에서 유전자 발현 프로 파일링에 강력한 도구입니다. 이 기술은 발달 생물학 및 독성학을 포함한 생물 학적 다양한 분야에 응용 프로그램을하고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 세부 zebrafish에 대한 포괄적인 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석을위한 프로토콜을.

Abstract

진 microarray 기술은 게놈 전체의 기준으로 명시 수준의 양적 측정과 유전자 발현 프로 파일링을 수 있습니다. 유전자 microarray 기술은 질병 상태로 발달 단계와 관련하여 세계적인 유전자 발현 분석을 포함한 다양한 응용 프로그램에서 다양한 생물 학적 분야에 사용하고, 독성 반응 인치입니다 여기에, 우리는 포괄적인 zebrafish 특정 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석의 데모를 포함합니다. zebrafish의 표현 microarray 플랫폼은 목표 당 12 프로브까지와 37,157 목표를 심문 385,000 프로브, 길이 60 기본 쌍을 포함하고 있습니다. 이 플랫폼은 zebrafish에 대해 사용할 수있는 모든 cDNA 및 게놈 정보는 Ensembl (http://www.ensembl.org), 베가 (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (포함한 다양한 게놈 데이터베이스에서 수집되었습니다 http://genome.ucsc.edu) 및 ZFIN (http://www.zfin.org). 결과적으로이 표현 배열은 현재 zebrafish의 transcriptome의 완전한 혜택을받을 수 있습니다. zebrafish의 표현 microarray는 로체 NimbleGen (매디슨, WI)에 의해 인쇄되었다. 이 기술 데모는 형광 cDNA 제품의 라벨, microarray 플랫폼에 표시된 제품의 cDNA 하이브 리다이 제이션, 그리고 한 색상 분석 전략을 사용하여 신호 획득을위한 배열 검사를 포함합니다.

Protocol

1 부 : cDNA의 형광 라벨링

microarray 실험에 사용된 Cy3 염료는 사진 저하에 민감합니다. 절차는 빛의 최소한의 자리를 차지할 것입니다. 라벨 프로토콜은 BioPrime 배열 CGH의 게놈 라벨 시스템 매뉴얼 ¹ 적응했다.

1. 라벨 반응에 대한 시약은 -20 ° C.에 저장됩니다 BioPrime 배열 CGH의 게놈의 라벨링 시스템 해동 2.5X 랜덤 프리머 버퍼, 10X dCTP 믹스, 그리고 nuclease없는 물. 또한 Cy3 - dCTP 염료를 녹여. 해동 후, 간단히 사용하기 전에 모든 시약을 원심 분리기.
2. 별도의 레이블 반응 분석 각 cDNA 샘플에 대해 완료해야합니다. 0.6 ML 두꺼운 벽으로 둘러싸인 튜브에 86 μl의 총 볼륨을 달성하기 위해 cDNA 500 NG, 40 μl 2.5X 랜덤 프리머 버퍼와 nuclease없는 물을 추가합니다.
3. 잘 믹스하고 짧게 원심 분리기. 100 5 분 반응 ° thermocycler에서 C를 품어.
4. 즉시 10 분 동안 얼음 목욕 슬러리에 반응을 전송합니다.
5. 각각의 튜브하려면 다음 10 μl 10X dCTP 믹스, 2 μl 1 ㎜ Cy3 - dCTP와 2 μl의 DNA 엑소 Klenow 효소를 추가합니다. 엑소 Klenow DNA의 효소가 필요 때까지 냉장고에 남아 있어야하며 항상 얼음에 보관해야합니다.
6. 잘 반응을 혼합하고 간단히 원심 분리기.
7. thermocycler 16 시간 동안 37 ° C에서 반응을 품어.

2 부 : 라벨 cDNA의 강수량

1. NimbleGen의 하이브리드화 시스템에서 프로토콜 차례로 계속하고 시스템이 42 ° C.에 평형 수 있도록하기 전에
2. 각 반응 들어, 1.5 ML 튜브에 Microcon 열을 넣으십시오. 라벨 반응 (100 μl)의 내용을 다음 각 열의 300 μl 0.1X SSC를 추가합니다.
3. 4 10 분 16,100 XG에있는 열을 포함하는 튜브 ° C.를 원심 분리기
4. 컬러로 약간 핑크색 수 있으며, 컬럼에 다른 300 μl 0.1X SSC를 추가할 수 있습니다 통해 흐름을 삭제.
5. 4 10 분 16,100 XG에서 원심 분리를 반복 ° C.
6. 을 통해 흐름을 취소하고 열 추가 300 μl 0.1X SSC를 추가합니다.
7. 4 12 분 16,100 XG에 원심 분리기 ° C.
8. 을 통해 흐름을 폐기하십시오. 을 통해 흐름이 마지막으로 씻고 나서 명확해야하고,이 칼럼에서 분홍색 표시 cDNA를 볼 수 있어야합니다.
9. 열 100 μl nuclease 무료 물을을 적용합니다. 1.5 ML 튜브에서 열을 제거하고 새로운 1.5 ML 튜브에 열을 반전.
10. 4 2 분 2,300 XG에 원심 분리기 ° C. 분류 cDNA는 튜브의 아래쪽에 수집 물 속에 rehydrated해야합니다.
11. DNA 농도를 계산하고 Cy3 비율 뉴클레오 티드가 23.15 곱한 ₂₆₀ / ₅₅₀ 비율을 동일 어디 비율을 염색하는 기지를 계산하여 염료 정관을 평가하는 제조 업체의 지시에 따라 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용합니다. 염색 비율 기지 50 80 사이 여야합니다.
12. cDNA 충분한 표시된 경우 경우의 나누어지는 6 μg는 새로운 1.5 ML 튜브로 cDNA 표시.
13. 3 M NaOAc, 산도 5.2의 0.1X 볼륨과 이소프로판올 1X 볼륨에 섞는다. 혼합물은 실온에서 30 분 어둠 속에 품어 수 있습니다.
14. 다음 실온에서 20 분 동안 16,100 XG에서 샘플을 원심 분리기.
15. 컬러 핑크되어야 DNA 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 주의깊게 폐기.
16. 500 μl 70 % EtOH 부드러운 역전의 믹스를 추가하여 에탄올 세척을 수행합니다.
17. 실온에서 5 분간 16,100 XG에 샘플을 원심 분리기.
18. 튜브 반전, 표면에 뜨는를 제거하고, 펠릿 5 분 동안 건조하실 수 있습니다. 이 단계에서는 펠렛은 -20에 저장될 수 있습니다 ° C 원하는 또는 프로토콜 하이브 리다이 제이션 단계로 계속 수있는 경우.

파트 3 : 하이브 리다이 제이션

하이브 리다이 제이션 절차는 유전자 발현 분석 ² 로체 NimbleGen 배열 사용자 가이드에서 적응됩니다.

1. nuclease - 무료 물 5 μl의 펠렛을 디졸브.
2. 일단 펠렛은 표 1에 나열된 하이브 리다이 제이션 구성 요소를 추가 해산합니다. 하이브 리다이 제이션 구성 요소는 로체 NimbleGen의 하이브 리다이 제이션 키트에서입니다. 모든 구성 요소가 추가되면 전체 볼륨이 18 μl 총해야합니다. 잘 믹스하고 간략하게 아래에있는 내용을 수집하기 위해 튜브를 스핀.
3. 다음 단계는 5 분 동안 95 ° C에서 열 블록에 배치하여 표시 cDNA를 변성하는 것입니다.
4. 배열은 다음 단계에서 준비하는 동안 즉시 NimbleGen의 하이브리드화 시스템에 튜브를 전송합니다.
5. Microarrays는 항상 신중하게 처리하고 제조 업체의 지침에 따라 보관해야합니다. 로체 NimbleGen는 실온에서 건조와 함께 어둠 속에서 자신의 표현의 배열을 저장하는 것이 좋습니다.
6. NimbleGen 배열 처리 액세서리에서 제공하는 정밀 믹서 정렬 도구 (PMAT)에 배열을로드합니다.
<리>는 PMAT에 X1 믹서를로드하고 집게와 접착 스트립을 제거합니다. 안전 PMAT를 닫습니다. PMAT에있는 구멍을 통해 믹서에 압력을 적용 천천히 배열 믹서는 PMAT에서 공격을 수 있도록 엽니다.
7. 단단히 배열에 인감을 위해 믹서의 외부 주위 브레 이어와 압력을 적용 완료하고 거품을 제거합니다. 따뜻하게 하이브 리다이 제이션 시스템에 배열 믹서 복잡한를 놓습니다.
8. 변위 피펫을 사용하여 천천히 입력 포트에 표시된 샘플의 15 μl를 추가합니다. 이것은 믹서의 중심에있는 구멍이다. 샘플 어떤 기포없이 믹서를 통해 균일하게 확산되도록 피펫으로 느리고 꾸준한 압력을 적용합니다. 포트 구멍에서 초과 샘플을 닦아 및 접착제 스트립과 포트 구멍을 밀봉.
9. 래치를 닫고 NimbleGen의 하이브리드화 시스템에서 프로그램 B를 사용하여 하이브 리다이 제이션 솔루션의 혼합 시작합니다. microarrays은 16-20시간에 대한 잡종 수 있습니다.

4 부 : 포스트 하이브 리다이 제이션 세척 및 Microarray의 스캔

세탁 및 검사 절차는 유전자 발현 분석 ² 로체 NimbleGen 배열 사용자 가이드에서 적응됩니다.

1. 일단 하이브 리다이 제이션은 표 2에 제시된 세척 버퍼를 준비 완료 근처​​에 있습니다. 42 미리 따뜻하게 씻으 버퍼 IA ° C 물 목욕 인치
2. GenePix 4000B 배열 스캐너 전원을 켜고 스캐너를 사용하기 전에 약 15 분 동안 따뜻한하실 수 있습니다.
3. 접시에 미리 따뜻하게 씻으 버퍼 IA 하거라.
4. 치구 (NimbleGen 배열 처리 액세서리로 제공)에 NimbleGen의 하이브리드화 시스템과 슬라이드에서 배열 믹서 복잡한를 제거합니다. 잠수함의 미리 따뜻하게 씻으 버퍼 IA에 조립 조심스럽게 거리 슬라이드에서 필링하여 믹서를 제거합니다.
5. 와시 버퍼 아이오와에서 15 초 동안 지그과 선동의 배열을 제거합니다.
6. 신속하게 실내 온도 와시 버퍼 IB의 슬라이드 선반에 배열을 전송합니다. 이분에 대해 적극적으로 슬라이드 선반을 선동하다.
7. 와시 버퍼 II에 슬라이드 랙을 전송하고 1 분 선동.
8. 15 초간 씻으 버퍼 III와 선동에 슬라이드 선반을 전송합니다.
9. 원심 분리기를 건조 슬라이드로 배열을 전송하고 모든 수분을 제거하는 2 분 돌린다. 스캔을 진행합니다.
10. 이것은 염료는 빛과 오존에 모두 민감한이기 때문에 즉시 배열을 검사하는 것이 좋습니다.
11. GenePix 4000B 배열 스캐너로, 아래로 배열, 바코드를로드합니다.
12. GenePix Pro 소프트웨어를 열고 배열의 스캔을 진행합니다. 로체 NimbleGen 유전자 표현 배열 한 색상 하이브 리다이 제이션 전략을 사용합니다. 결과적으로 하나의 파장은 스캔이 필요합니다. 532 NM 레이저를 사용하여 Cy3 형광 신호를 검사합니다. 하드웨어 설정 대화 상자를 열고 500 값을 532 nm의 레이저의 PMT 값을 설정합니다.
13. 하드웨어 설정 대화 상자에서, 100 %, 픽셀 크기 5 미크론으로, 평균 1 라인, 전원을 설정하고 0 미크론으로 위치를 중점을두고 있습니다.
14. 미리보기 스캔을 수행하고 스캔 영역을 설정합니다.
15. 스캔 수행합니다.
16. 일단 스캔은 이미지 히스토그램을 확인 완료됩니다. 이상 적으로는 1E - 5 표준 카운트는 기능 ~ 1~2%가 포화되는 65,000 포화 제한 의미에서해야합니다. 표준 카운트가 1E - 5보다 적은 경우, PMT 이득과 다시 검색 슬라이드를 향상시킬 수 있습니다. 표준 카운트가 1E - 5보다 큰 경우, PMT 이득과 다시 검색 슬라이드를 감소.
17. 일단 스캔은 이미지를 저장 완료됩니다. 그것은 참조에 쉽게 이미지에 대한 표준 명명 규칙을 선택하는 것이 좋습니다. 이미지는 이제 데이터 정상화와 강도 값을 계산에 대한 환경의 데이터 분석 프로그램에 로드할 수 있습니다.

대표 결과

당신이 먼저 0.1X SSC와 세척을 시작하면 cDNA의 Cy3 형광 라벨 반응의 효율성을 평가하기 시작할 수 있습니다. 이후의 각 세척하는 동안을 통해 흐름은 분명 통해 최근 흐름과 색상이 덜 분홍색이 될 것입니다. 또한, Cy3 - 라벨 cDNA 제품이 세척 단계 동안 열을 표시해야합니다. 을 통해 흐름이 컬러 밝은 분홍색 또는 열을 핑크색 제품이 없다면, 이것은 상표 반응이 제대로 진행되지 않은 좋은 표시이다. 라벨 반응은 양적 염료 비율 (그림 1)에 표시 DNA와 기지의 농도를 결정하는 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 레이블링 반응은 일상적으로 우리 연구실에 표시 DNA의 적어도 10 μg을 산출. 염료 법인은 Cy3 비율 뉴클레오 티드가 23.15 곱한 ₂₆₀ / ₅₅₀ 비율을 동일 간단한 기본 / 염료 비율을 사용하여 계산하실 수 있습니다. 50-80까지 값은 상표 반응에 충분한 염료 법인을 나타냅니다. 라벨 반응은 마이크에 DNA 또는 가난한 염료의 설립, 샘플 하이브 리다이 제이션의 낮은 농도를 산출하는 경우roarray 권장되지 않으며 라벨 반응은 반복해야합니다.

하이브 리다이 제이션의 품질 평가는 이미지 히스토그램 및 microarray의 스캔 이미지 (그림 2) 평가 실시하실 수 있습니다. 허용 hybridizations은 포화 기능 1-2 % (즉, 항복을 1E - 5 65,000 채도 제한에서 표준 계산)이 포함됩니다 500 근처에 설정된 PMT 값을. PMT 값을 65,000 채도 제한에 1E - 5 표준 계산을 달성하기 위해 500부터 대폭 조정해야있다면, 이것은 일반적으로 microarray에 표시된 cDNA의 가난한 하이브 리다이 제이션을 나타냅니다. 이 데이터는 이후의 분석을 통해 지속적인 경우에는 데이터 품질로 구성됩니다. 하이브리드화 품질도 질적으로 스캔 배열 (그림 3)의 이미지를 보면 평가하실 수 있습니다. 로체 NimbleGen의 하이브 리다이 제이션 키트 정렬 oligo의의 혼합 Cy3와 배열에 정렬 기능을 잡종 Cy5 - 라벨 48mer oligonucleotides가 포함되어 있습니다. 배열의 다른 기능에 대한 정렬 oligos의 강도의 질적 평가는 배열에 찬란 레이블 cDNA의 하이브리드화 효율에 대한 품질 검사를 허용합니다. 자세한 분석에 따라, 귀하의 분석 데이터의 스캐터 플롯은 유전자 발현의 상대적 수준을 결정하고 differentially하여 샘플 (그림 4) 사이에 표현됩니다 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 1. cDNA Cy3와 함께 표시. 라벨 cDNA 수율 및 염료의 정관에서 NanoDrop 스펙트럼은 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 2. 하이브 리다이 제이션의 microarray 검사합니다. 품질 GenePix 히스토그램은 이미지 히스토그램을 평가하여 평가하실 수 있습니다. 허용 hybridizations 500 근처에 설정된 PMT 값을 65,000 채도 제한에 1E - 5 표준 계산과 포화 기능이 1-2 %를해야합니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 3. 스캔 microarray 이미지. 하이브리드화 품질은 microarray의 스캔 이미지를 보면 평가하실 수 있습니다. 이미지가 기능의 형광 강도의 정확한 계산을 방지하므로 먼지 또는 각 기능의 시각화를 금지 기타 방해 요인의 존재에 대한 검사해야합니다. 정렬 oligos의 강도는 하이브 리다이 제이션 효율성을 평가하기 위해 배열의 다른 기능을 비교할 수 있습니다.

그림 4. 분석 microarray 실험의 스캐터 줄거리.이 절차의 목적은 differentially 귀하의 샘플에 표현됩니다 유전자를 식별하는 것입니다. Microarray 데이터가 추가로 분석하고 differentially 표현 유전자를 시각화하는 스캐터 플롯에서 볼 수 있습니다.

표 1. 로체 NimbleGen의 하이브 리다이 제이션 키트의 구성 요소 하이브 리다이 제이션 2 단계에 대한 추가합니다.

구성 요소	음량
샘플 (물속에 녹아있는)	5 μl
2X 하이브리드화 버퍼	9 μl
Hyb	3.6 μl
정렬 Oligo	0.4 μl
총 부피	18 μl

표 2. 하이브리드화 다음과 같은 배열의 세척에 대비하기 위해 버퍼를 씻으십시오.

구성 요소	와시 버퍼 IA *	버퍼 IB 와시	와시 버퍼 II	와시 버퍼 III
물	225 ML	225 ML	225 ML	225 ML
10X 워시 버퍼 I, II, III 또는	25 ML	25 ML	25 ML	25 ML
1 M DTT	25 μl	25 μl	25 μl	25 μl
총 부피	250 ML	250 ML	250 ML	250 ML

42 * 사전 따뜻한 ° C

Discussion

여기에 자세한 사람 등 많은 microarray 프로토콜은 하이브 리다이 제이션을 측정하고 quantifying의 수단으로 형광 염료를 사용합니다. Cy3 형광 염료는 사진 및 오존 파괴에 민감합니다. 이것은 프로 시저가 최소한의 조명을 실시하는 것이 좋습니다. 또한, 작은 먼지 입자는 하이브 리다이 제이션 및 스캔을 방해할 수 있습니다. 특별한주의는 작업 지역 깨끗하고 먼지에서 무료로 있는지 확인하기 위해 제공해야합니다.

이 절차에서 설명하는 라벨 프로토콜 많은 대안이 있습니다. 이것은 다양한 라벨 프로토콜은 각 특정 표현 microarray 플랫폼을위한 최적의 분류 절차를 확인하기 위해 테스트하는 것이 좋습니다. 절차 여기서 보여주는 로체 NimbleGen에 의해 인쇄된 특정 표현 어레이 플랫폼에 최적화되었습니다. 또한, 우리는 똑같이뿐만 아니라 일할 수있는 로체 NimbleGen 어레이 사용자 안내서에 설명된 상표 프로토콜을 발견했다. 하이브 리다이 제이션 속성 크게 플...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
어레이 마이크로 원심분리기 건조기	ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime 어레이 CGH 게놈 라벨링 시스템	Invitrogen	18095-011
시아닌 3-dCTP	PerkinElmer, Inc.	NEL576
GenePix 4000B	분자 장치	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30	EMD Millipore	42411
NimbleGen 어레이 처리 액세서리	Roche Group	5223539001
NimbleGen 하이브리드화 키트	Roche Group	5223474001
NimbleGen 하이브리드화 시스템 4	Roche Group
NimbleGen 세척 버퍼 키트	Roche Group	5223504001
X1 믹서	Roche Group	5223725001