우리는을 제시 체외에 두 컬러 유체 대상 이중층 단일 바이러스 입자의 융합을 시각화하기 위해 형광 분석. differentially 바이러스 멤브레인 및 인테리어 얼룩 fluorophores와 바이러스 입자를 분류함으로써, 우리는 hemifusion과 기공 형성 속도론을 모니터 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
막 융합이 세포로 싸여 바이러스의 항목 중에 필수적인 단계입니다. 기존의 퓨전 assays은 일반적으로 어려운 것인 관련된 분자 단계의 순서를 분석하고, 퓨전 이벤트의 다수에 대한 리포트입니다. 우리는 체외에서 본질적으로 유동적인 지원 대상 이중층 단일 바이러스 입자의 융합의 속도론을 모니터하는 두 색 형광 분석을을 개발했습니다.
인플루엔자 바이러스 입자는 멤브레인 및 바이러스 인테리어를 얼룩이 빨간색 친수성 형광단를 얼룩이 녹색 lipophilic 형광단와 incubated 있습니다. 우리는 흐름 세포의 dextran - functionilized 유리 표면에 ganglioside 함유 지질 이중층을 입금, CCD의 입자의 수백을 포함, 평면 이중층 및 이미지 100 X 100 μm의 두 영역의 형광에 바이러스 입자를 품어 카메라. 이미징 모두 빨간색과 녹색 형광함으로써, 우리는 동시에 막 색소 (녹색) 및 입자의 수성 내용 (빨간색)의 동작을 모니터링할 수 있습니다.
퓨전 산도 아래 값을 산도를 낮출되면 입자는 세포막과 융합됩니다. Hemifusion은 대상 막의 바깥쪽 전단지와 입소문 막의 바깥 전단지의 병합, 입자의 녹색 형광의 갑작스런 변화로 볼 수 있습니다. 남은 두 말초 전단지의 후속 융합되면 기공이 형성되고 바이러스 입자의 빨간 발광 형광단은 대상 막에 따라 공개됩니다. 이 행사는 개별 입자의 붉은 형광의 감소로 상승을 제공합니다. 마지막으로, 대상 막에 포함된 산도에 민감한 형광단에서 통합 형광이 산도 드롭의 정확한 시간에보고합니다.
세 형광 시간의 흔적에서 모든 중요한 이벤트 (산도 드롭, 기공 형성에 혼합 hemifusion, 컨텐츠에 따라 혼합 지질)는 이제 간단한 방법으로 개별적으로 모든 입자에 대한 추출하실 수 있습니다. histograms에 많은 개별적인 입자에 대한 다양한 변환에 대한 경과 시간을 수집하여, 우리는 해당 중간체의 수명을 결정할 수 있습니다. 직접 형광 관찰가 없어도 숨겨진 중간체는 이러한 histograms에서 직접 시각하실 수 있습니다.
프로토콜
유리 커버 슬립 작용화
퓨전 분석에 사용되는 평면 이중층은 dextran의 수산화 필름에서 지원됩니다. Dextran은 평면 이중층과 유리 표면 사이에 스페이서 역할을합니다. 이것은 유리 표면에 붙어되는 것을 막 구성 요소를 방지할 수 있으며 바이러스 입자의 내용이 융합시 탈출 수있는에 공간을 제공합니다. 유리 coverslips 우리가 화학적으로 결합 dextran에 유리 (Elender, 외. 1996) 수 실란 에폭시와 치료를 통해 작용하고 있습니다.
- 세라믹 얼룩의 랙에 25mm coverslips을 마련하고, JAR 또는 비커에 선반을 배치.
- 실험실 등급 유리 세제의 10 % 용액으로 컨테이너를 채웁니다. 30 분 초음파 청소기의 컨테이너를 놓습니다.
- 1M postassium 수산화와 용기와 coverslip 걸이 탈이온수과 함께, 그리고 리필 린스. 다른 30 분 동안 목욕 sonicator에 컨테이너를 반환합니다.
- 아세톤과 에탄올을 사용하여 청소 절차를 반복합니다.
- 물, 건조에 coverlips을 씻어.
- 마지막으로, 3 분 산소 플라즈마 스트리퍼 coverslips를 청소하십시오.
- 마....
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토론
유체 및 지속적인 지원 지질 bilayers의 준비 도전하실 수 있습니다. 물질 또는 표면 결함을 오염 미량의은 bilayers의 확산 방지합니다. dextran의 유니폼 레이어주의 청소와 증언이 필수적입니다.
바이러스 입자의 장시간 영상 표백제 형광 라벨을하거나 그들이 inactivated 될 발생할 수 있습니다. 이런 종류의 사진 손상이 잘 바이오 이미징 및 단일 분자 분야에 알려져 있고, 일반적으로 흥분 fluorophores의 반응 산소 종의 생성에서 줄기로 생각됩니다. 사진 피해를 최소화하기 위해, 우리는 일반적으로 여기 레이저의 파워를 최소화하고 사전에 실험을 시작하기 위해 장시간 노출하지 마십시오. 보고된 여러 산소 청소 시스템 중 하나를 사용하여 버퍼에서 산소 고갈이 유용 수 있습니다.
과도 중간 상태에 대한 정보를 얻을 수있는 능력이 융합 반응을 정확하게 동기화되어야합니다. 사용 유량과 입구 관 그리고 흐름 .......
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감사의 글
작품은 NIH 교부금 AI57159 (SCH)을하고 AI72346 (AMvO)을 지원했다. SCH는 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정이다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Corning 커버글라스 정사각형, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica 슬라이드 | Technical Glass | ||
| 염색 랙 | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| 콜레스테롤 | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein 접합체 | Invitrogen | S-869 | |
| 우뇌 유래 Disialoganglioside GD1a | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| 미니 압출기(Mini Extruder) | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron 폴리카보네이트 막 필터 | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm 드레인 디스크 (막 지지체) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b 나트륨염 | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | 합성 프로토콜은 Floyd et al. 2008 참조 | ||
| PD-10 탈염 컬럼 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon 형광 현미경 | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA 대물렌즈 | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr 레이저 | Coherent Inc. | ||
| 시린지 펌프 | Harvard Apparatus | 702213 |
참고문헌
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M.
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재인쇄 및 허가
