Denaturing 요소의 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)

요약

Denaturing 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동은 단일 좌초 DNA를 분리 또는 500 세포핵의 한계까지 RNA하는 데 사용됩니다. 열 denatures 샘플 및 구조화되지 않은 단일 가닥와 함께 요소는 분자량에 따라 겔 매트릭스 내에서 마이 그 레이션.

초록

요소 페이지 또는 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동을 denaturing는 보조 DNA 또는 RNA의 구조를 denatures 및 분자량에 따라 polyacrylamide 젤 매트릭스에서 분리에 사용되는 6-8 M의 요소를 고용합니다. 2-500 기지 사이의 조각은 단일 염기만큼 작은 길이의 차이로이 방법 ^1을 사용하여 분리 수 있습니다. 샘플의 마이 그 레이션 선택한 아크릴 아미드의 농도에 따라 좌우됩니다. polyacrylamide의 높은 비율의 낮은 분자량 조각을 해결합니다. 요소와 45-55의 온도의 조합 ° C 젤 실행하는 동안 비정형 DNA 또는 RNA 분자의 분리 수 있습니다.

일반적으로이 방법은 단일 좌초된 DNA 또는 효소 절단 반응에서 합성 또는 분류 oligonucleotides 또는 제품으로 RNA 조각을 분석하거나 정화가 필요합니다.

이 비디오를 문서에서 우리는 denaturing 요소의 polyacrylamide의 젤류을 준비하고 실행하는 방법을 보여줍니다. 기술 팁은 원래 프로토콜 ^1,2 이외에 포함되어 있습니다.

프로토콜

이 실험 절차에 대한 완전하고 상세한 텍스트 프로토콜은 분자 생물학의 현재 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 겔 샌드위치의 조립 및 겔 장치에 대한 자세한 단계별 지침은 BioRad 웹사이트 ³ 확인할 수 있습니다.

필수 장비 :
유리 접시 (내부 및 외부)
10cm 셀 : 10.1 X 7.3 cm (내부 판), 10.1 X 8.2 cm (외부 판), BioRad
20cm 셀 : 20 X 20cm (내부 판), 20 X 22.3 cm (외부 판), BioRad
0.5-1.5 mm 겔 빗과 스페이서
겔 주조 스탠드
덮개와 케이블로 젤 장치
고전압 전원 공급 장치
난방 장치 블록이나 물 목욕
Serological pipettes 및 피펫 에이드
피펫 및 피펫 팁
겔 건조기 스캐너

시약 및 솔루션 :
요소 (ultrapure)
40 % polyacrylamide 솔루션 (29:1)
10 × TBE 솔루션 (트리스 - Borate, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼)
Deion....

토론

1. 밴드 날카로움은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 선명한 밴드를위한로드 샘플의 볼륨 즉, 이상적으로 1-5 μl 사이에 가능한 작게해야합니다. 그러나, 최대 15 μl 여전히 허용 해상도를 보장하는 로드할 수 있습니다. 선명 밴드의 적은 샘플 량 결과.
2. 밴드 품질 또한 겔의 두께에 따라 좌우됩니다. 같은 0.75 mm로 얇은 젤은, 1.5 mm 두께 젤보다 더 나은 결과를 보여줍니다.
3. 샘플은 겔 주머니에 동일하게 적용되지 않은 경우 밴드의 모양도, 젤 로딩하는 동안 영향을받을 수 있습니다. 로딩 버퍼에 10 % 글리세롤을 포함하는 것은 물론 더 쉽게로 겔로드 및 샘플 싱크하는 동안 도움이됩니다.
4. 예상 제품 (들)가 로딩 염료 중 하나와 같은 수준에서 실행하면 샘플 로딩 버퍼와 연결되어있는 또 다른 잠재적인 문제가 발생할 수 있습니다. 또한, 형광 라벨을 사용하는 경우, 일부 염료는 비슷한 파장에서 형광 신호를 보여줍니다. 이 경우 한 염료 또는 모든 염료를 제거하는 경우이 문제를 해결할 수 있습니다........