초기 개발 단계 동안 원시 종자 세포로 차별화하는 배아 새싹 세포의 능력은 암, 불임에 관한 우리의 가설을 해결하기 위해 완벽한 모델입니다. 이 프로토콜은 10.5-11.5 일 게시 coitum 마우스 배아의 개발 생식선에서 원시 종자 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 새싹 세포의 기능 (예) 암, 불임에 관한 우리의 가설을 해결하기 위해 완벽한 모델입니다 초기 발달 단계 동안 원시 종자 세포 (PGCs)로 나중에 gametes로 구별합니다. 이 프로토콜은 10.5-11.5 일 게시물 coitum (DPC) 마우스 배아의 개발 생식선에서 원시 종자 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 마우스 배아에서 gonadal 능선을 개발 (C57BL6J) 다음 이전 mitotically 녹아웃 미디어의 존재에있는 mitomycin C와 inactivated과 백혈병 억제제로 보충되었다 마우스 배아 fibroblast 공급기 층 (MEF - CF1)에 도금 collagenase와 기계 파괴에 의해 dissociated되었습니다 팩터 (난생), 기본 Fibroblast의 성장 인자 (bFGF), 그리고 줄기 세포 계수 (SCF). 문화 조건 PCG 식별, 격리 및 설립을위한 이러한 최적화 방법을 사용하면 40 개 이상의 일간 EG 세포의 장기적인 문화를 수 있습니다. 태아의 새싹 세포 라인은 pluripotent 국가의 일반적인 사용 마커의 배아 표현형과 표현을 보여주었다. 분리 및 문화에 새싹 세포의 유도는 체외에서 개발을 이해하고 산화 스트레스에 노출 후 유전 및 epigenetic 수준에서 누적 손상을 모니터링하는 기회를 제공하는 도구를 제공합니다.
프로토콜
1 부 : 임산부 마우스 개복술
- 자궁 경부 전위를 사용하여, 10.5-11.5 DPC에서 임신 여성 C57BL6J 마우스를 안락사.
- 다음 항균 비누로 복부를 청소하고, 그것을 면도.
- 면도 후, 생리 식염수로 복부를 씻으십시오.
- 그리고, 멸균 거즈로 복부를 건조.
- 새로운 멸균 분야로 마우스를 커버.
- 포셉 및 해부 가위를 사용하여 복부 절개를합니다.
- 식별 및 복강에서 전체 자궁을 제거합니다. 마우스 배아는 자궁 안에 표시됩니다.
- D - PBS로 가득 배양 접시에 자궁을 전송하고, 얼음에 보관하십시오.
- 살균 메스와 집게를 사용하여 태반 및 각 배아의 여분의 배아 조직을 제거합니다.
- D - PBS로 가득 신선한 페트리 접시에 배아를 전송합니다.
- 마우스 배아의 길이를 측정합니다. 우리는 크기가 배아의 연령에 따라 다릅니다 것으로 나타났습니다. 예를 들어 8.5 DPC는 6mm의 평균 측정, 10.5 DPC는 11mm의 평균에서 측정하고, 12.5 DPC는 16 mm의 평균 측정.
- 그런 다음, DNA 추출을 위해 자신의 꼬리를 제거합니다.
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공개 사항
미시시피 주립 대학에서이 연구 검토 및 기관 애니멀 케어 및 마우스 프로토콜 # 08030 (프로토콜을 개최하고 사육 반응 산소 세균 라인 개발 및 종양 형성에 종 - ROS의 역할)의 이용위원회 (IACUC) 승인 후 실시했다.
감사의 글
; 박사 루시 센터, 닥터 Brigit Willeford 및 MSU ALAC 공인 마우스 시설에서 교육 및 동물 관리와 지원을위한 마이크 Basett, 박사 드웨인 와이즈 박사 닐 첫번째 원고 편집을위한 Kourtney 윌킨슨 : 저자의 귀중한 도움을 인정하고 싶습니다 세자르 Monroy, 한나 스우프 및 MSU에서 동영상 제작과 함께 자신의 도움 바비 허들 스턴, 현미경 및 이미지 캡처와 함께 자신의 도움을. 이 연구는 미시시피 주립 대학에서 기관 연구 및 생물 과학학과 사무실에서 후원했다.
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재료
포셉 제 14, 15, 메스 35mm, 해부 가위, 외과 분야, 항균 비누, 생리 식염수 0.9 %, 거즈, 얼음 폼 컨테이너, 면도날, 메스 35mm, 괜찮아요 포셉 제 4, 5, 괜찮아요 올린 바늘로 핸들, 종이 시트를 필터링하고, 유리 pipettes를 추출.
장비 : 해부 stereomicroscope, 광원 쇼트 Fostec, 거꾸로 현미경, micropipette 10 200ul, 원심 분리기, 바이오 안전 내각.
장비 : 해부 stereomicroscope, 광원 쇼트 Fostec, 거꾸로 현미경, micropipette 10 200ul, 원심 분리기, 바이오 안전 내각.
참고문헌
- DeFelici, M. Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, Second Edition, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: ....
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재인쇄 및 허가
