인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

요약

효모의 유전자 연구는 세포의 DNA 대사에 인간 유전자의 분자 및 세포 기능을 조사하기 위해 고용 수 있습니다. 방법은 인간의 유전 특성에 대해 설명합니다 WRN 유전자 제품입니다.

초록

유전자 경로에 인간의 DNA 수리 단백질의 역할을 이해하는 것은 많은 연구자에 대한 강력한 도전입니다. 포유류의 시스템에 유전자 연구가 정의 돌연변이 유전자 세포 라인, 규제 표현 시스템 및 적절한 선택 마커를 포함하여 즉시 사용 가능한 도구의 부족으로 인해 제한되었습니다. 이러한 어려움을 회피하려면, 낮은 eukaryotes의 모델은 유전 시스템은 기능적으로 보존 DNA 수리 단백질과 경로 연구를위한 매력적인 선택이되고 있습니다. 우리는 베르너 증후군 helicase - nuclease의 저조한 정의 유전자 기능을 연구하기위한 모델 효모 시스템 개발 (

프로토콜

1. 효모 레인스

야생 형 SGS1 TOP3와 종자 (WT, W303 - 1A, 유전자형, MAT ade2 - 1 canl - 100 his3 - 11, 15 leu2 - 3, 112 trpl - 전 ura3 - 1) [2], sgs1 돌연변이 (W1292 - 3C ; 유전자형 매트 SUP4 - O : URA3 sgs1 - 25 ade2 - 1 can1 - 100 his3 - 11, 15 leu2 - 3, 112 trp1 - 1 ura3 - 1 rad5 - 535)와 sgs1 top3 돌연변이 (W1058 - 11C, 유전자형, MAT SUP4 - O : URA3 sgs1 - 25 top3 - 2 : HIS3 ade2 - 1 can1 - 100 his3 - 11, 15 leu2 - 3, 112 trp1 - 1 ura3 - 1 rad5 - 535)가 [3] 특징되어 있고 친절하게 제공되었다 박사 로드니 Rothstein (콜롬비아 대학)에 의해.

2. 플라스미드 DNA의 건축

WRN 유전자가 같은 논의 스키마 다음 YEp112SpGAL에 복제되었습니다.

1. 플라스미드 YEp195SpGAL - WRN에 WRN의 사이트 이동 돌연변이 (E84A의 exonuclease 죽은 K577M helicase 죽은 R834C 및 K1016A) [4] Quickchange II XL 사이트 이동 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)에서 mutagenic primers와 표준 프로토콜을 사용하여 건설되었다 Lofstrand 실험실 (게이 더 스버그, MD).로
2. WRN과 관련된 변종을 인코딩 DNA 조각이 젤 살 I 및 Mlu I. 더블 소화 후 해당 YEp195SpGAL - WRN 구조에서 정화되었습니다
3. 젤 정화 조각 그러면 벡터 YEp112SpGAL, 그림 1과 같이 여자 - inducible 프로 모터의 제어하에 YEp112SpGAL WRN 또는 WRN 변종을 만들 TRP1 선택 마커를 포함하는 플라스미드 2 μm의 다중 복사본을 살 I Mlu I 사이트로 복제되었습니다 .
4. 그래서 얻은 구조는 YEp112SpGAL - WRN, YEp112SpGAL - WRN E84A, YEp112SpGAL - WRN K577M, YEp112SpGAL - WRN K1016A 및 YEp112SpGAL - WRN R834C로 선정되었습니다.

3. 변환

효모 배양은 리튬 아세테이트 기반 Gietz 외하여 프로토콜을 사용하여 표준 프로토콜과 변환을 수행했다를 사용하여 재배되었습니다 [5]. 간단히, 다음 단계를 수행했다.

1. 위에서 언급한 변종의 문화 5 ML YPD (효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트로 오스) 매체 밤새 성장했다. 문화 50 ML YPD 매체에 reinoculated되었으며 1.0 OD _600까지 성장할 수 있었다 - 1.2에 도달했습니다.
2. 문화는 20 ML의 물로 씻어, 수확, 100 MM 리튬 아세테이트 (LiAc) 1 ML에 resuspended되었습니다. 전지는 30 ° C 10 분 incubated되었습니다.
3. 세포 펠렛는 열명 변환을 할 수있을 정도입니다 500 μl의 최종 볼륨 100 MM의 LiAc에 resuspended되었습니다. 세포 현탁액의 50 μl가 aliquoted되었으며 세포 펠렛은 원심 분리에 의해 수집되었다.
4. 250 μl 50 % 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 1 M LiAc, 2 MG / ML ssDNA (연어 정자 DNA), 플라스미드 DNA의 5 ML (100 NG 25 μl 36 μl : 셀에 펠렛은 다음과 같은 순서로 추가되었습니다 1000 NG), 50 μl 물. 세포 펠렛는 1 분 vortexed했다.
5. 전지는 다음 30 incubated 있었다 ° C 42에서 열 충격에 의해 다음 30 분 ° C 20 분.
6. 세포 수확 및 1 ML 물에 resuspended되었습니다. 플라스미드 YEp112SpGAL가 선택 마커로 TRP가 포함되어 있기 때문에, 건축을 품고 모든 돌연변이 변종은 TRP는 능숙하게 것입니다. 따라서, transformants는 SC (합성 완료) 포도당 미디어 TRP이 부족해 30에서 접시를 잠복기에있는 정지를 도금하여 선정 ° 식민지가 나타날 때까지 C 3-4일하십시오.

4. WRN에 느린 성장 표현형 복원의 유전자 분석 sgs1 top3 응력을 바꾸었다.

1. 스트 리크 분석 :

1. 야생 형 부모의 성장 (W303 - 1A), sgs1 또는 sgs1 top3 종자 YEp112SpGAL 또는 YEp112SpGAL - WRN와 해당 변종 SC 마이너스 중 2 % 포도당을 (포함 TRP 플레이트에 줄무늬되었습니다에 WRN 표현의 효과를 확인하려면 GLU) 또는 2% 갈락토 오스 (여자). 컨트롤로 sgs1 top3 / YEp112SpGAL - SGS1이 포함되었습니다. 접시 2 일 동안 30 ° C에서 incubated했다.
2. 낮은 WRN 단백질 발현 수준에서 sgs1 top3 변형의 성장 속도에 영향을 WRN의 능력을 확인하려면 sgs1 top3 발표에서 여자의 다양한 농도를 포함 YEp112SpGAL, YEp112SpGAL - WRN로 변환하거나, YEp112SpGAL - SGS1은 SC 마이너스 TRP 플레이트에 줄무늬되었습니다 낮은 높이 2%로 0.005 %로. 플레이트는 다음 2 일간 30 ° C에서 incubated했다.
3. sgs1 top3 배경으로 느린 성장 표현형를 복원 WRN의 기능 요구 사항을 평가하기 위해, sgs1 top3가 YEp112SpGAL - WRN (E84A, K577M, R834C, 그리고 K1016A)로 변형 stre 있었다표시된 농도에 GLU 또는 여자 중 하나를 포함하는 SC 마이너스 TRP 접시에 에이크드. 컨트롤, YEp112SpGAL, YEp112SpGAL - WRN 또는 YEp112Sp GAL - SGS1로 변환 sgs1 top3 변형이 포함되었습니다. 플레이트는 다음 2 일간 30 ° C에서 incubated했다.

2. 액체의 문화 분석 :

1. 액체 문화의 변형 sgs1 top3 종자의 성장을 평가하려면, 효모 세포는 30 ° C 하룻밤에 SC RAF 마이너스 TRP에서 성장했다. 문화가 SC RAF 마이너스 TRP에 reinoculated와 30 ° C 초기 로그 단계 (~ 0.5 OD _600)로 성장했다. 문화는 그 2 %의 여자와 성장을 포함 SC 미디어에서 OD _0.05에서 reinoculated되었습니다 것은 지정된 시간 간격으로 흡광도를 측정하여 다음되었다.

5. WRN에서 hydroxyurea 또는 methylmethane - 산염 감도의 유전자 분석은 효모 변종을 바꾸었다.

1. YEp112SpGAL 또는 YEp112SpGAL - WRN로 변환 sgs1 또는 sgs1 top3 종자, 종자의 MMS 및 HU 감성에 WRN 표현의 효과를 확인하려면 30 SC RAF 마이너스 TRP 재배되었다 ° C.가
2. 문화가 SC RAF 마이너스 TRP에 reinoculated와 30 ° C 초기 로그 단계 (~ 0.6-0.8의 OD _600)로 성장했다.
3. 이러한 변종의 10 배로 시리얼 dilutions는 TRP을 부족한 SC 매체를 사용하여 준비되었습니다. 기하 급수적으로 증가하는 문화에서, 5 X 10 ⁶ 세포가 찍은 사진 및 10,000 배에 순차적으로까지 희석. 각 희석의 네 microliters는 HU 또는 MMS의 표시 농도를 포함하는 SC 여자 마이너스 TRP 플레이트에 발견되었다. 플레이트는 30 ° C.에 incubated했다
4. 제어로, 야생 형 부모 스트레인 (W303 - 1A)는 YEp112SpGAL 또는 YEp112SpGAL - WRN, 또는 sgs1 top3 / YEp112SpGAL - SGS1로 변환 위에서 설명한로 취급되었다.

6. WRN의 세포주기의 분포 sgs1 top3 응력을 바꾸었다.

1. WRN의 세포주기의 분포를 연구하려면 sgs1 top3 변형, YEp112SpGAL, YEp112SpGAL - WRN 또는 YEp112SpGAL - SGS1로 변환 sgs1 top3의 문화 및 벡터 변환 야생 형 부모 부담을 (W303 - 1A) 변형하면 SC RAF에서 성장했다 30 마이너스 TRP ° 하루를위한 C.
2. 문화가 OD _0.05에서 reinoculated 및 조기 로그 단계 (0.5 -0.6의 OD _600)까지 성장할 수있었습니다. WRN 표현은 2% 최종 농도 여자를 추가하여 유도되었다. 문화는 다음 30 성장 허용되었다 ° 6 H.위한 C
3. 문화가 다음 DAPI (4 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole) 염색법에 대한 처리되었습니다.
   1. 문화가 실온 (RT) 10 분 5,800 XG에서 원심 분리에 의해 수확했다.
   2. 세포와 함께 한 번 씻은되었습니다 1X 인산염 버퍼 호수 (PBS)를 다음 RT 20 분 70 % 에탄올에서 수정되었습니다.
   3. 고정 세포는 1 X PBS로 두 번 씻어, 마지막 1X PBS에서 resuspended되었습니다.
4. 세포 슬라이드에 배치하고 DAPI (1 μg / ML) (벡터, 미국)와 매체를 장착 Vectashield에 마운트되었습니다. 및 복합 차등 간섭 대비 (DIC), 세포 Axiovert 200 미터 현미경 (100x 렌즈 자이스 혈구)와 함께 조사했다. 형광 이미지는 AxioVision, 버전 3.0 프로그램 (자이스 혈구)를 사용하여 분석했다.

7. 서양 얼룩 분석합니다.

1. WRN의 단백질 표현하거나 변형 sgs1 또는 sgs1 top3 종자의 WRN 변종을 확인하려면, lysates은 다음 방법과 immunblotting으로 분석 단백질에 의해 준비되었다.

1. 변형 sgs1 또는 sgs1 top3 종자는 ° C 야간 30시 SC RAF 마이너스 TRP에서 성장했다.
2. 문화가 30 reinoculated 및 incubated되었습니다 ° C 초기 로그 단계 (0.5 OD _{600-0.8)까지} 다음 2퍼센트 최종 농도 여자를 추가하여 유도. 문화는 다음 30 성장 허용되었다 ° 6 H.위한 C
3. 셀 (3 ML)는 원심 분리 수집하여 PBS로 세탁했다. 세포 펠렛은 알칼리성 용해 버퍼 resuspended되었다 [50 MM NaOH, 산도 10.5, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 ㎜의 phenylmethylsulfonyl 불화 (PMSF), 2% SDS, 10 % 글리세롤, 5 % 2 - 메르 캅 토 에탄올 및 프로 테아제 억제제 (로체 분자 Biochemicals)] , 원심 분리에 의해 명확히 5 분위한 삶은, 1 M HCL로 무력화.
4. 세포 lysate의 상당 금액의 단백질은 8-16%의 polyacrylamide SDS의 젤에 해결이되었습니다.

2. 갈락토 오스의 농도 변화의 영향에 따라 WRN 단백질의 표현의 수준을 확인하려면, 문화는 다음과 같이 처리되었습니다.

1. 변형 sgs1 top3 종자는 하루 30 ° C에서 SC RAF 마이너스 TRP에서 성장했다.
2. 그리고 유도가를 추가하여 - 문화가 ° C 초기 로그 단계 (0.8 0.5 OD _600)까지 30 reinoculated 및 incubated되었습니다2퍼센트 최종 농도 리터. 문화는 다음 30 성장 허용되었다 ° 6 H.위한 C
3. 세포 (50 MM 트리스 - CL, 산도 7.5, 1 %의 나트륨 deoxycholate, 1 % 트리톤 X - 100, 0.1 %의 나트륨 dodecyl 황산염은 [SDS])가 포함된 프로 테아제 억제제 (0.05 % PMSF, 0.05 μg 원심 분리하여 수확하고 버퍼에 resuspended되었습니다 / ML 류펩틴).
4. 유리 구슬 (425-600 μm의)은 혼합물에 추가했고, 전지 vortexing에 의해 깨진되었습니다.
5. 그 결과 homogenate는 15,000 XG에서 5 분 centrifuged되었으며 뜨는 분수가 수집되었다.
6. lysate 분수의 단백질은 브래드 포드 방법으로 추정되었다.
7. 다른 lysate의 분수에서 단백질의 농도는 동일 8-16%의 polyacrylamide SDS의 젤에서 해결되었습니다.

3. WRN 또는 WRN 돌연변이 단백질의 표현은 WRN의 정화 C - 말단 조각에 에피토프에 대한 감독 WRN 마우스 단클론 항체를 사용하여 서양 얼룩에 의해 결정되었다 [6] (1:1000, 스프링 밸리 연구소).

4. 차 항체 보육는 보조 (와사비 퍼옥시데이즈 - 복합) 항체 (1:5000)과 부화 다음되었다. Blots은 제조 업체의 절차에 따라 ECL 플러스 서양 탐지 시스템으로 처리되었습니다.

5. 양적 서양 얼룩의 분석을 위해, 그의 - 태그 전체 길이 WRN 단백질이 얼룩의 부량시 표준 선형 곡선이 생성 될 수 같은 젤에 포함된 재조합 정화의 농도를 증가. 또한, 효모 lysate 샘플 셀 또는 20 μg의 상당 금액의 세포 추출물은 WRN의 농도를 추정하기 위해 젤에로드되었습니다.

6. ImageQuant 분석 후 생성된 젤류 및 표준 선형 곡선에서 수행되었다.

7. 다양한 여자의 농도에서 WRN 단백질의 농도는 위에서 생성된 표준 선형 곡선을 사용하여 추정되었다.

8. 대표 결과

이 연구에 사용된 모든 계통 TRP의 auxotrophs입니다. YEp112SpGAL 또는 YEp112SpGAL - WRN로 변형 따라서 sgs1, sgs1 top3 및 야생 타입 W303 - 1A의 종자는 SC 마이너스 TRP 미디어 존재의 성장 능력을 바탕으로 선정되었습니다. 변형 sgs1 top3 돌연변이 세포의 성장에 WRN 표현의 효과를 검토하려면 문화가 WRN 표현을 유도하기 위해 2 %의 여자에 SC 마이너스 TRP 미디어를 포함하는 접시에 줄무늬했다. Top3 decatenates 복제 [1, 2] 중 Sgs1 helicase에 의해 생성된 DNA 분자를 고리로 연결되었다는하므로, Top3의 부재에서, 비틀림 응력은 속도가 느린 성장과 하이퍼 재조합의 결과로 안심하지 않습니다. sgs1의 유전자 기능 top3의 돌연변이의 느린 성장 표현형을 억제하는 것입니다. WRN가 Top3와 유전자의 상호 작용 SGS1을 대신할 수있다면, sgs1 top3에 top3 느린 성장 표현형의 복원이 예상됩니다.

마찬가지로 그림 2A에 표시된 WRN는 sgs1 top3 부담은 훨씬 천천히 벡터에 비해 성장 변화 sgs1 top3 응력을 바꾸었다. sgs1 top3은 YEp112SpGAL - SGS1 플라스미드가 긍정적인 컨트롤 (그림 2A)로 포함되었습니다과 함께 변형, 그 야생 유형을 보여주는 sgs1 top3 돌연변이의 표현 Sgs1는 유전 성장 표현형를 보완 수있었습니다. 이일 (그림 2A)에 대한 그림과 같이 변형 sgs1 top3 계통 여자의 부재에서 마찬가지로 자랐습니다. WRN 표현 세포 성장에 WRN의 효과가 sgs1 top3 돌연변이 백그라운드에서 관찰되는 특정 것을 나타내는 부모의 야생 타입 (W3031A) 또는 sgs1 종자 (그림 2B)의 성장에 아무런 영향을 미치지 않았다. 유전자 연구는 WRN helicase하지만 exonuclease 활동이 top3 성장 표현형 (그림 3B)의 복원에 필요한 것을 증명 WRN 변종을 사용하여 수행했습니다. helicase 활동을 방해 WRN에서 자연스럽게 발생 missense의 다형성은 top3 느린 성장 표현형을 복원하기 위해 능력을 폐지.

top3 돌연변이 변종은 세포주기의 후반 S/G2 단계에 지연됩니다 [1] 그들의 느린 성장 계정 수있는 특성. top3 배경에있는 유전자의 돌연변이 SGS1은 세포주기의 S/G2 단계에 지연을 표시하지 않습니다. WRN 식은 sgs1 top3에서 세포주기의 S/G2 단계에 지연을 복원할 수있다면, 본격적 핵 대형 budded 세포의 높은 인구는 WRN을 표현 sgs1 top3 돌연변이 세포에 대한 기대됩니다. 그림 4와 같이, 큰 budded 세포의 비율은 S/G2 드의 복원을 제안, sgs1 top3 / 벡터보다 sgs1 top3 / WRN 높은되었습니다 top3의 특성을 믿는다.

sgs1 top3 이중 돌연변이가 top3 단일 돌연변이 [2]보다 MMS 또는 HU 적은 민감합니다. sgs1 top3의 WRN 영향을받는 세포의 성장 이후, 우리는 다음 methylmethane의 산염 (MMS, alkylating 에이전트)와 hydroxyurea (HU, 복제 방지제) sgs1 top3에 비해 약물 모두에. sgs1 top3 / WRN 표시 감도에 감도에 미치는 영향을 조사 / SGS1 (그림 5). WRN 변종의 유전자 분석 WRN helicase / ATPase지만 WRN exonuclease 활동이, MMS 및 HU에 감도에 미치는 영향에 필요한 것을 밝혔다.

그림 1. YEp112SpGAL 벡터에 클로닝 WRN / WRN 변종에 대한 설계도를 프레 젠 테이션하시기 바랍니다. 여기를 클릭하세요 그림 1의 더 큰 버전을 위해.

그림 2. sgs1 top3에 WRN 표현은 top3의 느린 성장 표현형을 복원합니다. 패널 YEp112SpGAL 또는 YEp112SpGAL WRN로 변형, sgs1 top3 변형이 2% GLU 또는 2 %의 여자 중 하나를 포함 SC - TRP 플레이트에 줄무늬했다. 제어로 YEp112SpGAL SGS1로 변환 sgs1 top3 변형은 접시 모두에 줄무늬되었습니다. 접시 2 일 동안 30 ° C에서 incubated 후 촬영했다. 패널 YEp112SpGAL 또는 YEp112SpGAL WRN로 변형 B, 거친 종류의 부모 스트레인 W303 - 1A 또는 sgs1 스트레인 2퍼센트 GLU 또는 2 %의 여자를 포함하는 두 SC - TRP 플레이트에 줄무늬되었습니다 . 접시는 4 일 동안 30 ° C에서 incubated 후 사진되었습니다. 접시의 구성은 A와 패널 B 각각 패널로했다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 3. WRN ATPase / helicase지만 exonuclease 활동은 sgs1 top3 배경으로 top3의 느린 성장 표현형를 복원해야합니다. sgs1 top3 변형이 (YEp195SpGAL WRN K577M) ATPase / helicase 죽은와 변형, exonuclease 죽은 (YEp195SpGAL - WRN E84A)는 RQC 돌연변이 (YEp195SpGAL - WRN K1016A), 또는 (YEp195SpGAL - WRN R834C) 돌연변이 다형성이 중 2% GLU (패널 C) 또는 2퍼센트 여자를 (패널 B)가 포함된 SC - TRP 플레이트에 줄무늬되었습니다. 접시 2 일 동안 30 ° C에서 incubated 후 사진되었습니다. 접시의 구성과 같이 패널 A.에 있었 주시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 3의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 4. WRN 표현은 YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN 또는 YEp112SpGAL SGS1로 변환 sgs1 top3 변형의 Logarithmically 성장 문화. sgs1 top3 세포에 S/G2 체포를 유도하고, 벡터 변형 야생 형 부모 변형이 2 % 여자 농도에서 유도되었다 6 H.위한 문화는 수확으로 재료 및 방법에서 설명한 DAPI의 얼룩에 대한 처리 및 Axiovert 200 미터 현미경 (자이스 혈구, 100x 렌즈)를 사용하여 관찰 하였다. YEp112SpGAL (왼쪽 위)와 변형 sgs1 top3 및 YEp112SpGAL WRN (오른쪽 상단)와 DAPI 얼룩은 표시됩니다. 화살표가 본격적 핵와 세포를 보여줍니다. G1 (단일 셀) 및 S/G2 (budded 세포)에서 세포의 배포는 낮은 패널에 표시됩니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 4의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 5. sgs1 top3 변형의 MMS 및 HU 감성에 WRN 표현의 효과는. Logarithmically YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, exonuclease 죽은 (YEp112SpGAL - WRN E84A), ATPase / helicase 죽은 (YEp112SpGAL WRN K577M)와 변형 sgs1 top3 변형의 문화를 성장 RQC 돌연변이 (YEp112SpGAL - WRN K1016A), 돌연변이 다형성 (YEp112SpGAL - WRN R834C) YEp112SpGAL SGS1 및 벡터는 부모의 변종이 GLU 또는 여자와 MMS 또는 HU 중 하나를 포함 SC - TRP 플레이트에 10 배로 직렬 dilutions에서 목격됐다 야생 유형을 변환 표시된 농도에서. 플레이트는 ° 다음 이일 (제어 접시)과 4 일 (MMS 및 HU 플레이트)에 대한 C와이 사진 30 incubated했다. 주시기 바랍니다9/1639fig5.jpg "> 그림 5의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

모델 시스템으로 효모를 사용의 장점 중 하나는 누룩과 인간 사이의 보존 아르 정의 DNA 복제 및 복구 경로에있는 돌연변이의 가용성이다. 실험실 변종이 auxotrophic 마커와 auxotrophic 돌연변이 벡터 아르 즉시 사용할 수 있으므로 특정 유전자를 숨겨주 transformants의 추가 선택은 간단하고 신뢰성이있다. 이러한 벡터를 사용하여 유전자 제품의 표현은 inducible업자의 통제 (예를 들어, 여자의 inducible업자 등)으로 그들을 배치하여 조정할 수 있습니다. 이러한 장점을 고려, 우리는 잠재적으로 인간과 효모 사이에 보존되어있는 경로에 베르너 증후군에 결함이 인간 WRN 유전자의 기능 요구 사항을 연구하는 효모 기반 모델 시스템을 개발했습니다. 설명 접근법을 사용하여, 우리는 WRN가 top3 관련 phenotypes에 영향을 미치는 유전자 경로에서 기능을 수있는 최초의 증거를 제공했습니다. 우리의 관측 WRN이 기능 세포의 DNA 복제 또는 재조합...