식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

요약

식물의 특정 세포 유형을 분리하는 방법을 시연합니다. 이 기법은 특정 세포 유형, 세포 분리 및 형광 활성 세포에 형광 단백질 정렬을 표현 형질 마커 라인을 사용합니다. 또한, 성장의 설정은 치료를 용이하게되는 여기 설립 Arabidopsis thaliana 모종.

초록

높은 해상도, 유전자 발현의 세포 유형의 특정 분석은 크게 발달 규제 및 모든 다세포 생물 환경 자극에 반응의 이해를 향상시킵니다. 원위치 하이브리드화와 리포터 유전자의 시각화에서 양적이를 데 사용 제한 범위 수 있지만 높은 해상도 RT - PCR 또는 특정 세포 유형에서 높은 처리량 transcriptome - 다양한 분석 RNA의 격리가 필요한 것입니다. 특정 세포 유형과 후속 형광 활성 세포 정렬 (외과)에 형광 단백질 마커를 표현하는 조직의 세포 분리는 가능한 RNA 추출, cDNA 합성 / 증폭 및 microarray 분석을위한 자료의 충분한 양을를 수집합니다.

셀 유형 - 특정 형광 기자 라인의 광범위한 집합은 식물 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다. 이 경우, Arabidopsis thaliana 루트 두 마커 라인이 사용됩니다 : P _SCR : GFP (endodermis 및 정지 센터)와 P _WOX5 : GFP를 (정지 센터). 모종 많은 (수천) hydroponically 또는 한천 플레이트에 성장하고 추가 분석을 위해 충분한 루트 자료를 얻기 위해 수확하고 있습니다. 식물의 세포 분열은 세포 벽 소화 효소에 의해 이루어진다. 이 절차는 높은 osmolarity - 유도 plasmolysis 및 상용 cellulases을 사용하게, pectinases 및 hemicellulases이 솔루션에 protoplasts을 해제합니다.

GFP 양성 세포 외과는 488 nm의 레이저에 의해 흥분 protoplasts의 붉은 방출 스펙트럼 대 녹색의 시각화을 사용합니다. GFP 양성 protoplasts은 빨간색으로 방출하는 녹색들의 증가 비율로 구분할 수 있습니다. Protoplasts는 일반적으로 RNA 추출 버퍼에 직접 정렬하고 나중에 추가 처리를 위해 저장됩니다.

이 기술은 간단하고 실용적인 것으로 드러났습니다. 또한, 그것은 심지어 매우 부족한 세포 유형 (예 : 정지 중심 세포)에 대한, 그것이 transcriptome 분석을 위해 세포의 충분한 숫자를 분리하는 어려움없이 사용할 수 표시됩니다. 마지막으로, Arabidopsis 모종의 성장 설정은 그 (셀 타입 - 특정 biotic 또는 비생물적 스트레스 응답의 분석 예) 셀 정렬하기 전에 식물의 단순한 치료를 가능하게 증명합니다. 잠재적인 보조는 식물 protoplasts의 외과에 대해 설명합니다.

프로토콜

식물 1) 준비

1. Protoplasts는 효소를 소화 세포 벽의 오른쪽 혼합이 ^1을 사용된다는 가정하에 다양한 식물 종 및 조직에서 얻을 수 있습니다. 본격적인 실험이 수행되기 전에, 소재의 작은 규모의 소화는 조직의 protoplasting 효율성, 효소 등을 평가하고 셀 정렬에 대한 %로 긍정적인 세포를 추정하기 위해 좋습니다. 여기, 셀 타입 - 구체적으로 표현하는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하는 Arabidopsis thaliana의 모종의 뿌리에서 파생된 protoplasts. endodermis와 정지 센터는 P _SCR로 표시됩니다 : GFP와 P _WOX5에 의해 정지 센터 : : GFP ^2,3 (그림 1).
2. 뿌리 (0.22 % W / V Murashige와 Skoog 기초 매체 [시그마], 1 %의 성장 매체로 통해 성장 수, 나일론 필터 (NITEX 250 μm의 메쉬)에, 모종은 (그림 2A 시그마) phytatrays에서 hydroponically 재배 W / V 자당, 0.05 % W / V MES [2 - (N - morpholino) ethanesulfonic의 산] 코와 산도 5.7....

토론

Protoplasts는 원칙적으로 유리한 조건을 최적화하는 것은 크게 RNA의 품질과 수량을 향상시키는, 식물 조직의 다양한에서 파생된 수 있습니다. protoplasting 솔루션 및 사용 선택 부화 버퍼 모두이 부분에 영향을 미칠 것이다.

여러 가지 형광 단백질을 사용 외과의 기능에 따라 사용할 수 있습니다, 예를 들어 GFP, RFP, YFP, CFP하거나 많은 변종 및 파생 상품. 마커의 표현이 여기에 같이뿐 아니라 세포 유형의 특정 발기인 또는 확장기 트랩에 의해 구동뿐만 아니라, 여러분이 좋아하는 발기인에 의해 호르몬 응답 합성 리포터 유전자 ⁵ 예 수 있습니다. 식물 protoplasts의 듀얼 컬러 외과도 가능합니다. 형광 긍정적인 선택 마커 ⁵ 벡터를 사용하여 과도 변환 분석을 수행할 때이 예를 들어, 적용할 수 있습니다.

Protopla.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
250 μm 나일론 메쉬	Sefar 여과	NITEX 03-250/50
100 μm 나일론 메쉬	Sefar 여과	NITEX 03-100/47
사각형 페트리 접시	Fisher Scientific	죄송합니다. 번역할 원문 텍스트가 제공되지 않았습니다. 번역이 필요한 영문 텍스트를 입력해 주시면, 요청하신 지침에 따라 전문적인 한국어 과학 학술 번역을 제공해 드리겠습니다.
식물 재배 트레이	Sigma-Aldrich	P1552
Murashige and Skoog 기본 배지 (MS)	Sigma-Aldrich	M5519
자당	Fisher Scientific	S5-3
2-N-Morpholinoethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M2933
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	10 M 스톡 용액
Eclipse 90i 현미경	Nikon Instruments
셀룰라아제 R-10	야쿠르트 제약
Macerozyme R-10	야쿠르트 제약
D-만니톨	Sigma-Aldrich	M9546
KCl	Sigma-Aldrich	P8041	1 M 스톡 용액
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich	A3912
β-메르캅토–에탄올	Calbiochem	444203
CaCl22	Sigma-Aldrich	C2536	1 M 스톡 용액
궤도 진탕기	Labline Instruments
40 μ세포 스트레이너	BD Biosciences	352340
원추형 15ml 튜브	BD Biosciences	352196
탁상형 원심분리기	Sorvall, Thermo Scientific	Legend RT
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
FACSAria	BD Biosciences
1.5 ml 마이크로원심분리관	VWR international	20170-38
RNeasy micro kit	Qiagen	74004
WT-Ovation Pico RNA 증폭 시스템	NuGEN	3300_12
FL-Ovation cDNA Biotin Module V2	NuGEN	4200_12